초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
◦ 세부과제명: 산란계 유래 가금티푸스균의 특성 조사
- 산란계에서의 가금티푸스 발생사례 조사
∘ 총 13가지의 조사항목(45가지 세목)을 설정한 “산란계농장 방역점검표”를 이용하여 충북, 충남, 전남, 전북, 경북, 경기 등지의 11개 가금티푸스 발생 산란계 농장과 최근 3년간 가금티푸스 발생이 없는 23개 산란계 농장을 대상으로 위생방역수준을 비교분석한 결과, 비발생농장에서 방문객 및 차량의 출입관리와 소독을 보다 철저히 이행하고 있었고(P<0.05), 외부기생충 방제 등 위생적 사양관리

5. 최종 연구결과 요약
◦ 세부과제명: 산란계 유래 가금티푸스균의 특성 조사
- 산란계에서의 가금티푸스 발생사례 조사
∘ 총 13가지의 조사항목(45가지 세목)을 설정한 “산란계농장 방역점검표”를 이용하여 충북, 충남, 전남, 전북, 경북, 경기 등지의 11개 가금티푸스 발생 산란계 농장과 최근 3년간 가금티푸스 발생이 없는 23개 산란계 농장을 대상으로 위생방역수준을 비교분석한 결과, 비발생농장에서 방문객 및 차량의 출입관리와 소독을 보다 철저히 이행하고 있었고(P<0.05), 외부기생충 방제 등 위생적 사양관리에서도 차별성를 보였음(P<0.05)
∘ 생균백신 접종계군에서의 발생 피해사례 조사 분석의 일환으로 가금티푸스 생균백신을 접종한 산란계군 유래 폐사계에서 분리한 가금티푸스균에 대한 생균백신주 여부를 조사하여 5건의 백신주에 의한 가금티푸스 병변 유발 사례를 확인하였음
∘ 전북 진안 소재 가금티푸스 피해 지속 산란계군(30주령, 3만수)에 대한 현장 및 가검물 조사 결과, 계군에 가금티푸스 생균백신 2회 접종후 가금티푸스 불활화 오일백신이 추가 접종된 상황에서 심한 간장의 종대, 유약 및 출혈과 혈액 응괴물의 복강내 저류가 나타났으며, 고면역에 의한 아밀로이드증 발생으로 가금티푸스 피해가 지속되는 것으로 판단됨
- 가금티푸스균 분리주의 virulence 비교 조사
∘ 최근 분리 가금티푸스균의 병원성 인자의 유전적 변이 정도를 조사하기 위하여 2002년부터 2009년까지의 야외분리균주(병원성균 61주, 백신균 5주)를 대상으로 환경저항성 및 병원성과 관련된 주요 조절유전자인 rpoS의 염기서열을 분석하여 총 11가지의 allele이 존재함을 확인하였으며, 야외분리 백신균 5주는 모두 rpoS 유전자의 변이를 보이지 않았음
∘ 상기의 야외분리균주를 대상으로 PFGE를 이용한 유전자형 분석을 실시하여 80% 이상의 유전적 상관성을 보이는 4가지의 대표적 유전자형을 확인하였으며, 야외분리 백신균 5주 (9R 4주, SR2-N6 1주) 모두 각각의 종균과 동일한 유전자형을 보였음
∘ 최근 분리 가금티푸스균의 병원성 정도를 평가하기 위하여 rpoS의 allele type 및 PFGE 양상을 토대로 병원성균 10주를 선발하여 균의 성장률 및 닭에서의 병원성을 조사한 결과, 선발된 10주의 병원성균의 균성장율 및 닭에서의 병원성에서 유의한 차이가 확인되지 않았음
∘ 야외분리 백신균 5주(9R 4주, SR2-N6 1주)와 이들의 원 백신균주의 성장률 및 닭에서의 병원성을 조사한 결과, 닭에서의 병변 및 폐사유발은 확인되지 않았으나, 야외분리 9R 백신균주는 원래 백신균주보다 상대적으로 높은 균성장율을 보였으며(3주), 접종닭의 실질장기에서의 균회수율도 상대적으로 높았음(4주)
∘ 닭 세포주(간세포, 탐식세포)를 이용한 실험실적 병원성 시험에서는, 야외분리 9R 백신균주(4주), SR2-N6 시판백신주(1주) 및 야외분리 백신균주(1주)가 병원성균 보다 간세포 침습성이 상대적으로 높았으며, 탐식세포내 생존능은 감염 20시간 후 일부 병원성균(4주), SR2-N6 시판백신주(1주) 및 야외분리 백신균주(1주)에서 상대적으로 높게 나타났음
◦ 세부과제명: 가금티푸스균 신속동정법 및 유전자형 분석법 개발
- 가금티푸스균 신속동정법 개발
∘가금티푸스균의 유전적 감별진단을 위하여 유전체 염기서열이 결정된 가금티푸스균 287/91의 염기서열과 GenBank의 다양한 살모넬라 혈청형 유래 동일 유전자의 염기서열을 비교분석하여 균종감별에 용이한 2개의 유전자(glgC, speC)를 확인하였음
∘ 확인된 2개의 유전자(glgC, speC)를 대상으로 가금티푸스균과 추백리균의 특이적 감별을 위한 duplex PCR법을 개발하였으며, 총 131주의 살모넬라균 및 유사 장내세균에 대한 적용시험에서 민감성과 특이성이 모두 100%로 나타났음
∘ 가금티푸스 생균백신주 9R을 야외주와 감별하는 유전자 진단법을 개발하기 위하여 가금티푸스 생균백신주 9R에 특이적인 유전자 부위를 suppression subtractive hybridization을 통해 검색하였으며, 9R을 특이적으로 검출하는 데 유용한 유전자 부위(clone 9R22C9)를 확인하였음
∘ 기존의 duplex PCR 조성에 상기 9R 특이 부위에 대한 primer set, 다른 생균백신주 SR2-N6의 rfaL 유전자내 특이 결손부위에 대한 primer set 등을 추가한 multiplex PCR법을 개발하였으며, 131개의 균주 패널로 검사한 결과, 비특이 반응 없이 야외균주와 생균백신주 9R 및 SR2-N6을 동시에 특이적으로 검출하여 국내 산란계 현장에서 가금티푸스균, 추백리균 및 가금티푸스 생균백신 균주를 신속하게 감별 동정하는 것이 가능하게 되었음
- 염기서열에 기초한 유전자형 분석법 개발
∘ 유전체 염기서열이 결정된 가금티푸스균(287/91)과 Salmonella Enteritidis(P125109)의 유전체 염기서열을 이용하여 각각 62개와 61개의 variable-number tandem repeat(VNTR) 부위를 확인하였고, 이를 토대로 가금티푸스균 유전자형 분석에 유용한 4개의 VNTR 부위(SGTR1~SGTR4)를 최종적으로 선발하였음
∘ 선발된 4개의 VNTR부위를 증폭하기 위한 multiplex PCR 조건을 설정하였으며, 4개의 다른 dye(6-FAM, VIC, NED, PET)가 각각 부착된 4개의 프라이머 세트를 이용하여 설정된 조건의 PCR을 수행한후 fragment analysis를 수행하여 가금티푸스균 68주에 대하여 총 26가지의 allelic profile을 확인하여 multi-locus VNTR analysis(MLVA) 기법을 확립함
∘ 동일한 68주에 대한 기존의 PFGE(23 pattern)와 MLVA(26 profile) 기법의 유전자형 감별의 유용성 정도를 평가하기 위하여 diversity index(DI) 값을 구하였으며, 이를 바탕으로 가금티푸스균의 유전자형 분석에 MLVA(0.918)를 병행할 경우 PFGE(0.874)의 균주감별력을 개선할 수 있음을 확인함

Abstract ▼

Salmonella Gallinarum causes fowl typhoid in chickens and has been of economic importance to the chicken industry in Korea. In 2001, a live vaccine based on an attenuated Salmonella Gallinarum 9R (SG 9R) strain was introduced to commercial layer farms in Korea. Subsequently, the number of reported c

Salmonella Gallinarum causes fowl typhoid in chickens and has been of economic importance to the chicken industry in Korea. In 2001, a live vaccine based on an attenuated Salmonella Gallinarum 9R (SG 9R) strain was introduced to commercial layer farms in Korea. Subsequently, the number of reported cases of fowl typhoid decreased substantially. Currently, two live vaccines of Salmonella Gallinarum (SG 9R and SG SR2-N6) have been used in commercial layers. Nevertheless, outbreaks of fowl typhoid continue to occur in commercial layer farms. Therefore, we prepared a checklist to examine factors which interfere with Salmonella Gallinarum live vaccine efficacy in commercial layers. The checklist mainly focused on farm biosecurity, sanitation measures, and other management conditions. From this investigation, we found farms affected with fowl typhoid were under much poorer sanitary conditions. We also, examined genotypic and phenotypic properties of Salmonella Gallinarum field isolates, including wild types and vaccine strains, to see any increases in virulence of field isolates with time after introduction of live vaccines. We performed pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA), and in vitro and in vivo virulence tests with field isolates between 2002 and 2009. However, there were not any significant changes in their genotypic properties. Nevertheless, some vaccine strains reisolated from chicken carcasses showed a slight increase in their virulence. Further studies are needed to see if live vaccine strains may recover their original virulence in field conditions.

목차 Contents

• 총괄요약표 ... 1
• 연구과제 최종결과보고서 ... 4
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• Ⅲ. 연구결과 ... 8
• 가. 제1세부과제명 ... 8
• 나. 제2세부과제명 ... 18
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 31
• Ⅴ. 고찰 ... 33
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 35
• Ⅶ. 참고문헌 ... 35
• Ⅷ. 영문초록 ... 37
• 끝페이지 ... 37