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문제 정의
- gallinarum 9R 균주는 특허 등록이 되어있지 않은 관계로 본 균주를 이용한 백신의 생산은 의외로 자유로운 반면 국내 시판을 위해서는 매번 실험실적인 안전성과 효능 및 국내 야외농장에 대한 안전성 및 효능평가가 동시에 실시되어야 한다. 본 연구는 앞으로도 지속적으로 본 균주를 이용한 백신이 생산될 가능성이 큼에 따라 현재 국내에서 판매되고 있거나 시판을 준비중인 백신을 대상으로 균주의 특성과 더불어 안전성 및 효능을 재평가해보고자 실시되었다. 시험결과, 동일한 균주라 하더라도 계대횟수 등 균주의 성상에 영향을 줄 수 있는 여러 소인들이 있음에도 불구하고 3곳의 제조회사 유래 S.
- gallinarum 9R 균주의 계대횟수, 보관방법 및 보관기간 등 균주의 역학자료가 뚜렷하지 않아 생물학적, 생화학적 성상 및 안전성과 면역원성에 차이가 나타날 수 있으며, 따라서 국내에서는 본 균주를 이용한 백신생산의 허가시 균주의 특성 , 실험실적 안전성 및 면역원성, 또한 야외농장에서의 안전성 및 면역원성을 시험하도록 요구하고 있다. 본 연구의 목적은 현재 국내 및 외국기업으로부터 생산, 시판되고 있는 S. gallinarum 9R 균주를 이용한 생균백신이 야외농장에서 널리 사용되고는 있지만, 생산회사별 제품의 효능평가가 과학적인 근거자료 없이 다양하게 이루어지고 있어 양축농가에 혼선을 가져다주고 있음에 따라 현재 국내 실용산란계 농장에서 사용되고 있거나 시판을 준비하고 있는 백신을 대상으로 균주의 특성, 실험실적 및 야외농장에서의 안전성 및 면역원성을 동일한 조건에서 비교, 조사해 보고자 하였다.
제안 방법
- 백신의 면역원성은 1회백신 또는 2회 백신 후 공격접종을 실시하여 조사되었다. 1회백신에 대한 면역원성 조사를 위해서는 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고 3주후에 야외주인 Sg- 98252균주를 경구로 2 x 108 cfU되게 접종하였다. 2회 백신 후 면역원성 조사는 동일한 백신을 6주령의 갈색산란계에 1차접종한 후 11주령에 2차접종을 실시하고, 3 주후인 14주령에 Sg-98252주를 2x108 cfU되게 경구접종하였다.
- 1회백신에 대한 면역원성 조사를 위해서는 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고 3주후에 야외주인 Sg- 98252균주를 경구로 2 x 108 cfU되게 접종하였다. 2회 백신 후 면역원성 조사는 동일한 백신을 6주령의 갈색산란계에 1차접종한 후 11주령에 2차접종을 실시하고, 3 주후인 14주령에 Sg-98252주를 2x108 cfU되게 경구접종하였다. 공격접종 후 2주간의 폐사율과 2주후 부검을 실시하여 간, 비장 및 맹장에서 공격균주인 Sg-98252의 균분리를 실시하였다.
- 갈색산란계를 사육하는 야외 농장 중 1계군의 수가최소 3, 000수 이상이 되며 과거 가금티푸스 발생 경력이 있는 KB 농장, BS 농장 및 MD 농장을 임의로 선정하여 농장의 백신스케쥴에 따라 Nobilis SG9R 백신 및 BNP SG9R 백신을 6~7주령에 1차접종 및 15~18주령에 2차접종을 실시하였으며, 백신 비접종 대조군을 두어 시험종료시까지 같은 계사내에서 동거사육하였다. 이때 Nobilis SG9R 접종군 및 BNP SG9R 접종군은 각각 계군수의 45%가 되게 접종하였으며 백신 비접종 대조군은 계균의 10%가 되게 하여 케이지 최상단에 사육하면서 백신접종군과 직접 접촉이 되지 않도록 하였다.
- 2회 백신 후 면역원성 조사는 동일한 백신을 6주령의 갈색산란계에 1차접종한 후 11주령에 2차접종을 실시하고, 3 주후인 14주령에 Sg-98252주를 2x108 cfU되게 경구접종하였다. 공격접종 후 2주간의 폐사율과 2주후 부검을 실시하여 간, 비장 및 맹장에서 공격균주인 Sg-98252의 균분리를 실시하였다. 균분리는 각 장기를 swab하여 RV broth에 접종하여 24시간 배양한 후, 이를 MacConkey agar 에 도말하였으며 무색 집락이 나타날 경우 Mucap reagent(Bio-rad, USA)로 형광을 띄는 집락만 순수분리하여 Salmonella group D1 항혈청과의 응집반응에서 양성을 나타낼 경우 Sg-98252주로 판명하였다.
- 국내 실용산란계 농장에서 현재 사용되고 있거나 시판을 준비하고 있는 S. gallinarum 9R 생균백신을 대상으로 균주의 특성, 실험실적 및 야외농장에서의 안전성 및 면역원성을 비교, 조사해본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5 ml plug wash TE bufifeH 넣은 후 4oC에서 보관하면서 사용하였다. 냉장된 plug를 꺼내어 면도날을 이용하여 1 2 mm의 두께로 자른 다음, plug slic를 SmaI으로 25oC 에서 24시 간 동안 제 한효소 처 리 하였으며, CHEF Mapper XA chiller system(Bio-Rad, USA를 이용하여 1% Sekem gold agarose(Cambrex, USA)상에서 gradient 6.0 v/cm, angle 120oC, initial time 2.16 초, final time 63.8 초의 조건으로 14oC 에서 18 시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료 후 ethidium bromide 용액 (0.
- 조사항목은 백신균량 측정, 백신접종반응출현여부, 3주간의 증체량, 백신균주에 기인한 폐사발생여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였다. 백신의 면역원성은 1회백신 또는 2회 백신 후 공격접종을 실시하여 조사되었다. 1회백신에 대한 면역원성 조사를 위해서는 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고 3주후에 야외주인 Sg- 98252균주를 경구로 2 x 108 cfU되게 접종하였다.
- 시험균주를 tryptic soy broth(TSA; Biolife, Italy) 에 접종하여 37oC에서 24시간 배양하고 이를 MacConkey agar(Biolife, Italy)에 이식하여 배양한 후, 각각 3개 이상의 집락을 선택하여 특성시험을 실시하였다. 생화학적성상을 비교하기 위하여는 Edwards 등 [12]과 Christensen 등 [11]의 방법에 따라 운동성, D-glucose첨가 당배지에서의 gas 산생능, dulcitol, maltose 및 rhamnose 분해능, ornithine 이용능 및 주석산 이용능을 조사하였으며, 혈청학적 성상 조사는 제조회사의 방법에 따라 Salmonella D1 항혈청 (Difto, USA)과의 평판응집반응을 실시하였다.
- 가금티푸스방역실시요령’에 따른 검사에서 살모넬라 음성종계군으로 확인된 종계 유래 1일령 실용산란계 병아리로 실험실로 운반하여 격리사육장치에서 시험개시까지 사육하였으며, 시험개시 직전에 사육수수의 10% 이상에 대하여 추백리진단액 및 Salmonella group D1 ELISA kit를 이용하여 살모넬라 감염여부를 확인 후 시험에 사용하였다. 안전성 조사를 위하여 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분 및 10수분씩을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고, 접종 후 21일동안 관찰하였다. 조사항목은 백신균량 측정, 백신접종반응출현여부, 3주간의 증체량, 백신균주에 기인한 폐사발생여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였다.
- 이때 Nobilis SG9R 접종군 및 BNP SG9R 접종군은 각각 계군수의 45%가 되게 접종하였으며 백신 비접종 대조군은 계균의 10%가 되게 하여 케이지 최상단에 사육하면서 백신접종군과 직접 접촉이 되지 않도록 하였다. 야외농장에서의 백신의 안전성을 확인하기 위하여 33주령까지 백신접종반응 출현여부, 백신균주에 기인한 폐사발생 여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였으며, 야외농장에서 사육되는 실용산란계에 대한백신의 면역원성을 조사하기 위하여 33주령때 Noblis SG9R 접종군, BNP SG9R 접종군 및 백신 비접종 대조군 20수를 무작위로 선발하여 실험실로 운반하고 18시간 절식시킨 다음, 야외분리주인 Sg-98252주를 2 x 108 cf되게 경구접종하였다. 공격접종 후 2주간의 폐사율과 2주후 부검을 실시하여 간, 비장 및 맹장에서 공격균주인 Sg-98252의 균분리를 실시하였다.
- 이때 Nobilis SG9R 접종군 및 BNP SG9R 접종군은 각각 계군수의 45%가 되게 접종하였으며 백신 비접종 대조군은 계균의 10%가 되게 하여 케이지 최상단에 사육하면서 백신접종군과 직접 접촉이 되지 않도록 하였다. 야외농장에서의 백신의 안전성을 확인하기 위하여 33주령까지 백신접종반응 출현여부, 백신균주에 기인한 폐사발생 여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였으며, 야외농장에서 사육되는 실용산란계에 대한백신의 면역원성을 조사하기 위하여 33주령때 Noblis SG9R 접종군, BNP SG9R 접종군 및 백신 비접종 대조군 20수를 무작위로 선발하여 실험실로 운반하고 18시간 절식시킨 다음, 야외분리주인 Sg-98252주를 2 x 108 cf되게 경구접종하였다.
- 8 초의 조건으로 14oC 에서 18 시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료 후 ethidium bromide 용액 (0.5 μg/ml)세 gel 을 넣어 염색하여 분절을 확인하였으며, 표준 marker로는 DNA size standard lambda ladder(Bio-RAD, USA)를 사용하였다.
- 안전성 조사를 위하여 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분 및 10수분씩을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고, 접종 후 21일동안 관찰하였다. 조사항목은 백신균량 측정, 백신접종반응출현여부, 3주간의 증체량, 백신균주에 기인한 폐사발생여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였다. 백신의 면역원성은 1회백신 또는 2회 백신 후 공격접종을 실시하여 조사되었다.
대상 데이터
- Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R에서 분리한 S. gallinarum 9R 균주, 표준균주인 S. gallinarum ATCC 9184 및 야외분리주 Sg-1, Sg-2, Sg-3, Sg-4, Sg-5, Sg-6 및 Sg-7을 시험에 사용하였다.
- 가금티푸스방역실시요령’에 따른 검사에서 살모넬라 음성종계군으로 확인된 종계 유래 1일령 실용산란계 병아리로 실험실로 운반하여 격리사육장치에서 시험개시까지 사육하였으며, 시험개시 직전에 사육수수의 10% 이상에 대하여 추백리진단액 및 Salmonella group D1 ELISA kit를 이용하여 살모넬라 감염여부를 확인 후 시험에 사용하였다. 안전성 조사를 위하여 Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 1수분 및 10수분씩을 6주령의 갈색산란계에 피하로 접종하고, 접종 후 21일동안 관찰하였다.
- 인터베트코리아에서 시판하고 있는 Nobilis SG9R 백신 (Nobilis SG9R), 코미팜에서 시판하고 있는 9R VAC 백신 (9R VAC) 및 고려비엔피에서 시험 생산한 BNP SG9R 백신 (BNP SG9R)을 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 공격접종 후 2주간의 폐사율과 2주후 부검을 실시하여 간, 비장 및 맹장에서 공격균주인 Sg-98252의 균분리를 실시하였다. 균분리는 실험실내 안전성 및 면역원성 조사와 동일한 방법으로 실시하였으며 통계학적 유의성은 Student /-test를 이용하여 p <0.05 이하의 유의성만을 통계학적 차이로 인정하였다.
- 균분리는 각 장기를 swab하여 RV broth에 접종하여 24시간 배양한 후, 이를 MacConkey agar 에 도말하였으며 무색 집락이 나타날 경우 Mucap reagent(Bio-rad, USA)로 형광을 띄는 집락만 순수분리하여 Salmonella group D1 항혈청과의 응집반응에서 양성을 나타낼 경우 Sg-98252주로 판명하였다. 조사항목에 대한 통계학적 유의성은 Student /-test를 이용하여 p <0.05 이하의 유의성만을 통계학적 차이로 인정하였으며, 모든 시험은 3반복 실시 및 각 시험구별 시험계는 15수를 원칙으로 하였다.
이론/모형
- 미 국질 병 통제 센 터 (Centers for Disease Control and Prevention)의 'PulseNet'에서 사용되는 pulsed field gel electrophoresis(PFGE) 표준실험법에 준하여 실시하였다 [10]. 공시균을 TSA 에 접종한 후 37oC 에서 18-24 시간 배양하고, colorimeter(BioMerieux Vitec, USA)를 이용하여 2 ml cell suspension TE buf!er(100 mM Tris; pH 7.
- 생화학적성상을 비교하기 위하여는 Edwards 등 [12]과 Christensen 등 [11]의 방법에 따라 운동성, D-glucose첨가 당배지에서의 gas 산생능, dulcitol, maltose 및 rhamnose 분해능, ornithine 이용능 및 주석산 이용능을 조사하였으며, 혈청학적 성상 조사는 제조회사의 방법에 따라 Salmonella D1 항혈청 (Difto, USA)과의 평판응집반응을 실시하였다.
성능/효과
- 1. Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R에서 분리한 S. gallinarum 9R 균주 모두 동일한 생화학적, 혈청학적 특성 및 PFGE 패턴을 나타내었으며, 표준 및 야외강독형의 S. gallinarum 균주들과는 rhmnose 분해능, Salmonella group D1 항혈청과의 응집능 및 PFGE에서 뚜렷한 차이를 나타내었다.
- 2. 시험백신들의 실험실내 안전성 및 면역원성을 조사한 결과, 백신의 종류에 상관없이 1수분 용량 및 10수분 용량 접종 모두에서 안전성이 확인되었으며, 또한 백신비접종 대조군과 비교시 유의성있게 낮은 폐사율과 공격균주 분리율을 나타내었다.
- 3. Nobilis SG9R 및 BNP SG9R의 야외 농장에서의 안전성 및 면역원성을 조사한 결과, 백신의 종류에 상관없이 33주령까지 백신접종반응, 백신균주에 기인한 폐사발생 및 백신균주에 기인한 임상증상이 발견되지 않았으며, 백신비접종 대조군에 비해 유의성있게 낮은 폐사율과 공격균주 분리율을 나타내어 뚜렷한 방어효과를 확인할 수 있었다.
- Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R에서 분리한 S. gallinarum 9R 균주 모두 동일한 생화학적 및 혈청학적 특성을 가지고 있었으며, 표준 및 야외 강독형의 S. gallinarum 균주들과 비교시 rhmnose 분해능 및 Salmonella group D1 항혈청과의 응집능에서 차이를 보여 이들 두 방법을 이용시 백신균주 및 야외 분리주와의 감별이 가능함을 알 수 있었다 (Table 1).
- SmaI 제한효소를 이용하여 PFGE 패턴분석을 실시한 결과, Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R에서 분리한 S. gallinarum 9R 균주 모두 동일한 패턴양상을 나타내었으며, 표준 및 야외 강독형의 S. gallinarum 균주들과는 뚜렷한 차이를 나타내었다 (Fig. 1).
- 4). 또한 Nobilis SG9R 및 BNP SG9R 백신 모두 동일한 효능이 확인됨과 아울러 33주령까지 백신 접종반응 출현여부, 백신균주에 기인한 폐사발생 여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였으나 특이한 사항은 발견되지 않았다.
- 8〜 100%와 비교시 백신접종군 모두 유의성있게 낮은 폐사율을 나타내었다. 또한 실질장기에서의 공격균주 재분리율에서도 백신접종군은 시험백신의 종류에 상관없이 백신비접종 대조군와 비교시 유의성있게 낮은 균분리율을 나타내었다(Table 3).
- 본 연구는 앞으로도 지속적으로 본 균주를 이용한 백신이 생산될 가능성이 큼에 따라 현재 국내에서 판매되고 있거나 시판을 준비중인 백신을 대상으로 균주의 특성과 더불어 안전성 및 효능을 재평가해보고자 실시되었다. 시험결과, 동일한 균주라 하더라도 계대횟수 등 균주의 성상에 영향을 줄 수 있는 여러 소인들이 있음에도 불구하고 3곳의 제조회사 유래 S. gallinarum 9R 균주 모두 동일한 생화학적 및 생물학적 성상과 아울러 PFGE에서 야외 분리주와는 뚜렷히 구분되는 동일한 패턴을 보였다.
- 시험백신 균주의 안전성을 확인하기 위하여 6주령 산란계에 1수분 용량 및 1^분 용량을 접종하고 3주후에 증체 량, 임상증상 및 폐사율을 조사한 결과, Nobilis SG9R, 9R VAC 및 BNP SG9R 접종군 모두 백신비 접종 대조군과 비교시 증체량에 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 특이한 임상증상 및 폐사 또한 관찰할 수 없었다 (Table 2).
- 시험백신의 실험실적 면역원성을 확인하기 위하여 6 주령 산란계에 1회 접종 및 6주령과 11주령에 2회 접종한 시험계에 대해 야외 강독형의 S. gallinarum 을 공격접종 한 결과, 1회 또는 2회 백신을 접종한 시험군의 폐사율은 2.2〜8.9%로 백신비접종대조군의 폐사율 97.8〜 100%와 비교시 백신접종군 모두 유의성있게 낮은 폐사율을 나타내었다. 또한 실질장기에서의 공격균주 재분리율에서도 백신접종군은 시험백신의 종류에 상관없이 백신비접종 대조군와 비교시 유의성있게 낮은 균분리율을 나타내었다(Table 3).
- 시험백신의 야외 농장에서의 효능을 알아보기 위하여, 3곳의 야외농장에 대하여 Nobilis SG9R 및 BNP SG9R 2종의 백신을 농장의 백신프로그램에 맞게 2회 접종 한 후 33주령때 실험실로 운반하여 공격시험을 실시한 결과, 백신비접종군의 폐사율은 95~100%인 반면두 종류의 백신을 접종한 시험계에서는 농장별로 5~30% 의 폐사율만 나타내어 본 백신의 야외 적용시 백신비접종군에 비해 유의성있게 낮은 폐사율을 나타냄을 알 수 있었으며, 실질장기에서의 공격균주 재분리율에서도 백신비접종군의 분리율이 장기별 차이는 있었으나 50~100%임에 반해, 백신접종군에서는 10~65%를 나타내어 백신비접종군과 차이가 있음을 확인할 수 있었다 (Table 4). 또한 Nobilis SG9R 및 BNP SG9R 백신 모두 동일한 효능이 확인됨과 아울러 33주령까지 백신 접종반응 출현여부, 백신균주에 기인한 폐사발생 여부 및 백신균주에 기인한 임상증상 발현여부를 확인하였으나 특이한 사항은 발견되지 않았다.
후속연구
- 동일한 균주를 바탕으로 외국 및 국내 기업에서 생산하고 있는 백신이 혼합되어 시판되고 있는 국내 상황에서 이들 백신의 효능에 대하여 야외농장에서는 다양한 평가들이 이루어지고 있었으나 정작 과학적인 성적은 아직까지 보고된 바 없기에 본 성적은 이들 백신에 대한 객관적인 효능평가 자료로 충분하다고 판단되며, 백신균주와 야외 분리주의 생물학적 및 유전학적 차이는 백신균주의 병원성 복귀 등 균주의 변이가 발생시 중요한 참고자료가 될 것으로 생각된다.
- gallinarum 9R 균주는 전세계적으로 특허되어 있지 않은 상황이며 따라서 국내 업계에서는 외국의 주요 연구기관에서 본 균주를 분양받아 백신을 생산하였고 현재 3개의 국내기업에서 백신을 생산, 시판하고 있으며 또한 1개의 기업에서 현재 생산을 준비중에 있다. 앞서 말한 바와 같이, 현재 S. gallinarum 9R 균주는 특허 등록이 되어있지 않은 관계로 본 균주를 이용한 백신의 생산은 의외로 자유로운 반면 국내 시판을 위해서는 매번 실험실적인 안전성과 효능 및 국내 야외농장에 대한 안전성 및 효능평가가 동시에 실시되어야 한다. 본 연구는 앞으로도 지속적으로 본 균주를 이용한 백신이 생산될 가능성이 큼에 따라 현재 국내에서 판매되고 있거나 시판을 준비중인 백신을 대상으로 균주의 특성과 더불어 안전성 및 효능을 재평가해보고자 실시되었다.
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