초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
가. 국내외분리주 분석
2000년 국내분리주(충주)의 동물실험(소, 염소)유래 프로방시료 분석을 통한 지속감염조사 (real-time RT-PCR)결과 국내분리주에 의한 지속감염 형성이 없음을 확인하였다.
나. 지속감염주의 특징적 변이 분석
영국측에서 송부한 양에서의 동물실험유래 시료를 확보(O1 Manisa로 백신접종후 2001년 영국발생 바이러스로 공격접종하여 임상증상 및 지속감염 여부를 확인한 실험)하여 분석한 결과 기 보고된 바와 같이 특정(VP2) 부위에서 지속감염 결과로 나타

5. 최종 연구결과 요약
가. 국내외분리주 분석
2000년 국내분리주(충주)의 동물실험(소, 염소)유래 프로방시료 분석을 통한 지속감염조사 (real-time RT-PCR)결과 국내분리주에 의한 지속감염 형성이 없음을 확인하였다.
나. 지속감염주의 특징적 변이 분석
영국측에서 송부한 양에서의 동물실험유래 시료를 확보(O1 Manisa로 백신접종후 2001년 영국발생 바이러스로 공격접종하여 임상증상 및 지속감염 여부를 확인한 실험)하여 분석한 결과 기 보고된 바와 같이 특정(VP2) 부위에서 지속감염 결과로 나타나는 한 개의 아미노산 서열변화가 관찰되었다. 동일 개체내에서 일어나는 이러한 바이러스의 경시적인 변이를 반정량적 (semi-quantitative)인 방법으로 조사할 수 있는 allelic discrimination 방법을 개발하여 그 사용 가능성을 확인하였다.
다. 지속감염주의 세포수용체별 감염 특성 조사
2001년 영국에서 분리된 바이러스가 지속감염 전후에 특징적인 변이를 나타낸다는 점에 착안하여 이러한 변화가 구제역바이러스의 수용체의 사용 및 선택과 어떠한 상관성이 있는가를 조사한 결과, 지속감염이후에 구제역바이러스는 수용체의 사용에 있어서 비교적 덜 선택적임을 확인하였다.
라. 2002년 국내분리주를 이용한 감염성 클론 제작
구제역 전체지놈(2002년 돼지분리주)의 pBluescript 벡터내 삽입을 확인하였고, site directed mutagenesis를 통해 전체서열이 완전하게 분석된 10종 이상의 구제역 cDNA 클론을 작성하였다. 이들 클론을 In-vitro transcription을 통해 RNA를 합성한 후 세포내 transfection 을 하거나 플라스미드 DNA를 직선의 가닥으로 단편화하여 T7 RNA polymerase가 발현되는 세포에 도입하여 바이러스를 획득하는 프로토콜 확립하였다.
구체적으로 보면 reverse genetics를 이용한 구제역바이러스 병원성 인자 규명 연구를 위해 필요한 구제역바이러스의 cDNA클론을 작성하여 그 감염성(Infectivity)를 최종 확인하였다. 감염성 확인은 cDNA 클론 플라스미드를 단일부위를 절단하는 제한효소를 사용하여 단편화 (linearization)한 후 DNA형태로 T7 RNA polymerase를 발현하는 세포(BHK T7/9)에 전달(transfection)하거나, in-vitro transcribed RNA를 돼지신장유래세포인 IBRS-2세포에 RNA transfection하는 경우 모두에서 가능하였다. cDNA 클론으로부터 획득된 바이러스의 역가 및 전체서열을 확인하였고, 이 클론을 기초로 하여 병원성 연구(숙주특이성 인자 확인)에 필요한 chimeric clones을 설계하였고, 관련 프라이머를 작성하여 mutagenesis를 위한 클로닝 작업을 실시하였다. 4종의 chimeric clone 을 작성하여 최종 4종의 chimeric virus를 획득하였으며, 목적 동물실험에는 최종 2종의 감염성 클론 유래의 바이러스를 공시하였다. 돼지 및 소를 대상으로 돼지 및 소유래 바이러스(감염성클론으로부터 획득함)를 접종하여 병원성의 차이를 분석한 결과 바이러스의 종류에 따른 축종별 병원성의 차이를 확인할 수 있었다.
마. 재조합센다이바이러스 제작 및 동물실험 결과
재조합 센다이바이러스제작을 위한 구제역 지놈의 P1-2A, 3C subcloning를 완료하고 발현을 확인한 뒤 최종적으로 A22 바이러스주의 P1-2A 및 3C유전자가 삽입되고 해당 유전자를 세포에 효과적으로 전달하여 발현되도록 할 수 있는 센다이재조합바이러스를 획득하는데 성공하였다. 이 바이러스로부터 발현된 구제역 항원의 성상 및 크기를 전자현미경으로도 확인하였다. 이 재조합바이러스는 F 유전자가 삭제된 것으로서 센다이바이러스 고유의 병원성을 제거하여 유용유전자 전달체로서 효과적이며 특히 소의 비강 및 호흡기 쪽의 세포에 효과적으로 감염되어 구제역 유전자의 발현을 유도할 수 있음이 확인되었다. 이렇게 구제역 바이러스의 입자가 충실히 발현 조합되고 전달되는 부위가 소의 호흡기도 및 비강 세포를 포함할 수 있다는 사실은 구제역의 지속감염을 억제하기 위한 국소부위 면역 증대에 효과적일 수 있음을 시사하고 있다. 이렇게 확인된 재조합 바이러스를 동물면역원성 실험을 위한 대량 증식을 실시하였으며 실험동물에서 그 면역원성을 측정한 결과 구제역바이러스에 대한 체액성 면역은 크게 증가되지 않은 것으로 나타났다. 그러나, 면역세포에 대한 proliferation assay 등의 결과등을 살펴 볼때 목적동물에서의 점막면역 및 국소면역에 효과적일 가능성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼

The persistent infection in FMD is frequently observed and general phenomenon, and the animals persistently infected are called carriers. So the carrier has the site of viral replication in the respiratory tissue after recovery following viral infection. Even after vaccination, the occurrences of pe

The persistent infection in FMD is frequently observed and general phenomenon, and the animals persistently infected are called carriers. So the carrier has the site of viral replication in the respiratory tissue after recovery following viral infection. Even after vaccination, the occurrences of persistent infection are still observed because inactivated vaccines currently used in the world does not elicit sterile immunity in the animals. Vaccination is an important method of foot-and-mouth disease control and currently relies on use of chemically inactivated culture grown FMDV virions formulated with adjuvants and given by intramuscular injection. Although conventional vaccines can prevent clinical infection, protection is short lived; often requiring frequent revaccination and does not induce rapid protection against challenge. There is increasing evidence, predominantly from studies in mice that intranasal vaccination is superior to vaccination at other sites in eliciting protection against mucosal pathogens. An effective way of stimulating mucosal immunity is the use of live recombinant virus vectors such as adenoviruses or Sendai virus (SeV). The main aim of the project is to develop a strategy for inducing local innate and adaptive immune responses against FMDV. This will be achieved by investigating the interaction of recombinant SeV or AdV expressing FMD virus capsids with bovine airway epithelial cells, in vitro, and comparing their ability to induce local innate and FMDV-specific immune responses, in vivo.
The viral genomic regions affecting the virulence of foot-and-mouth disease have limitedly been explored using homotypic or intertypic recombinants constructed by manipulating infectious cDNAs. Functional analysis of genetic components of a viral genome using reverse genetics is widely used in RNA viruses. Several infectious clones of FMDV have already been established.
Recently, analysis of chimeric viruses derived from cDNA clones demonstrated that the porcinophilic property of a Taiwanese strain isolated in 1997 was associated with the deletion of ten amino acids in the 3A. The porcinophilic property of O/SKR/2002 was revealed by the field evidences that fifteen out of sixteen cases were from pig farms, and this has subsequently been confirmed by animal experiments between the collaborative works between Korean and USA.
The strain that was isolated from the infected cattle during the outbreaks in 2002 was very close to the pig strain in genomic sequences with 12-18 mismatches in amino acid residues across the coding region between the strains.
In relation to persistent infection, an FMDV strain from Korea (O/SKR/Paju/2000) is different from other viruses in that it rarely persists in infected cattle producing no carriers. This phenomenon may imply that some viral factors are important in determining the occurrences of carriers.
So in this study, in the background of the limited study on the mechanism and outcome of the persistent infection, we focused on the development of recombinant vaccine to target the respiratory sites for maximizing local or mucosal immunity by using sendai virus vector system. At the same time, we tried to search the viral factor aross the viral complete genome which are related with persistent infection or host tropism using the samples collected from field outbreak or animal experiment. As a result, we could test vaccine strategy that could enhance local mucosal adaptive immune responses to FMDV and confirm that there were viral factors for porcinophilic tropism of O/SKR/2002 pig strain, and we tried to identify the extent of the interaction of the viral or host factors in persistent infection.
More in detail, the coding sequences of FMDV A22 serotype P1-2A and 3C was be inserted into recombinant SeVΔF with some displacement to control the negative effect of 3C. SeVΔF which does not produce infectious progeny virus was used to rescue SeV-FMDV-P1-2A-3C by the application of reverse genetics technology. Previous studies have already demonstrated that it is possible to express FMDV P1 from another paramyxovirus, e.g. rinderpest virus. The rescued recombinant SeV wasl be characterised by RT-PCR followed by sequencing, immunoblot and immunofluorescence studies to confirm expression of the
inserted genes. The FMDV viral particles were also found to be produced after infection. Immunity of rSeV expressing capsid proteins was examined in experimental animals. The ability of these constructs to activate bovine monocyte-derived dendritic cells was checked.
For pathogenesis study, we constructed infectious clones for the recovery of chimeric FMDVs. We found the evidences of RNA replication after the transfection in-vitro transcribed RNA. After the investigation of infectivities of those clones, the target regions of interest was modified or replaced for constructing any chimeric viruses in relation to host specificity or persistent infection. With these clones we tested their virulence in pigs and cattle, and could see there were differences in pathogenesis of the two viruses, one is pig-originated and the other one is cattle-oriented

목차 Contents

• 총괄요약표 ... 1
• 연구과제 최종결과보고서 ... 4
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• Ⅲ. 연구결과 ... 9
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 24
• Ⅴ. 고 찰 ... 25
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 25
• Ⅶ. 영문초록 ... 26
• 끝페이지 ... 27