초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구는 국내에서 분리된 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5 기반으로 하는 백신 플랫폼을 구축하기 위하여 pPIV5 바이러스 역유전학 기법을 개발하고 이를 활용한 외래 병원체 단백질 항원 발현용 바이러스 벡터 시스템 개발을 목적으로 한다. 그에 대한 연구내용은 다음과 같다: (1) pPIV5전체 염기서열 분석을 포함한 분자 유전학적 특성 규명 연구 (2) pPIV5 병원성을 포함한 in vivo 특성 규명 연구 (3) pPIV5 바이러스에 대한 국내 유병율에 대한 연구 (4) pPIV5 바이러스 감염성

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구는 국내에서 분리된 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5 기반으로 하는 백신 플랫폼을 구축하기 위하여 pPIV5 바이러스 역유전학 기법을 개발하고 이를 활용한 외래 병원체 단백질 항원 발현용 바이러스 벡터 시스템 개발을 목적으로 한다. 그에 대한 연구내용은 다음과 같다: (1) pPIV5전체 염기서열 분석을 포함한 분자 유전학적 특성 규명 연구 (2) pPIV5 병원성을 포함한 in vivo 특성 규명 연구 (3) pPIV5 바이러스에 대한 국내 유병율에 대한 연구 (4) pPIV5 바이러스 감염성 클론 제작을 포함한 역유적학 기법 개발 구축에 관한 연구 (5) 숙주세포에서 클론 바이러스의 감염성 및 증식성을 포함한 in vitro 특성 연구 (6) 구축된 역유전학 기법을 적용한 외래 단백질발현 재조합 pPIV5 바이러스 제작에 관한 연구 (7) 숙주세포에서 재조합 pPIV5 바이러스 감염성 및 증식성을 포함한 in vitro 특성 연구 (8) 재조합 pPIV5 바이러스의 숙주동물내 면역원성을 포함한 in vivo 특성 연구

□ 연구결과
본 연구에서는 실험실에서 자체적으로 구축한 독자적인 세포주를 이용하여 국내에서 처음으로 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5)를 분리하는데 성공하였으며, 이를 KNU-11으로 명명하였다. pPIV5 KNU-11 바이러스 전체 염기서열을 분석한 결과 SH 유전자의 시작 코돈과 종결 코돈이 natural knockout되어 SH 단백질이 생성되지 않는다는 것을 추정하였으며 이는 기존에 다른 파라인플루엔자 바이러스 연구들에서 알려진 대로 SH 단백질이 바이러스 감염 및 증식에는 비필수 유전자임을 확인하였다. 한편, KNU-11의 숙주세포 감염 시 특징을 확인하기 위해 in vitro 상에서의 접종실험을 수행한 결과 특이적인 세포변성효과를 관찰하였고 감염된 돼지폐포대식세포숙주에서 염증성 사이토카인과 케모카인의 높은 발현 수준을 확인하였다. 돼지 접종실험을 통해 병원성을 알아본 결과, 감염 기간 동안 특이적인 임상증상을 관찰할 수 없었으나 효과적으로 체액성 면역반응을 유발하는 것을 확인하였다. 위에 언급되어진 in vitro 및 in vivo 특징들을 미루어볼 때 KNU-11 분리주가 바이러스 기반 벡터로서 연구될 이용가치가 있다고 판단되었으며 이를 위해 KNU-11 유래 전장 감염성 cDNA 클론 제작을 통한 역유전학 기법을 개발하였다. 개발된 역유전학 기법을 이용하여 세포에 transfection한 후 그 상층액을 숙주세포에 계대접종하여 cloned pPIV5 바이러스를 획득하였다. 클론 유래 pPIV5 바이러스의 감염성 및 증식성을 세포변성효과 및 형광염색법을 통하여 관찰하였고, 기존 parental 바이러스와의 비교 실험을 통해 유사한 역가 및 성장곡선을 확인하였다. 구축된 KNU-11 감염성 클론 기반 바이러스 벡터 시스템을 확립하기 위해 KNU-11 바이러스의 비필수 단백질인 SH 유전자 코딩 부위에 대신 외부유래 유전자를 도입을 통한 재조합 바이러스 제작을 시도하였다. 이를 위해 외부 단백질 항원인 GFP와 PEDV S 유전자를 각각 도입하여 이를 발현시키는 변이 클론을 제작하였으며 각각으로부터 rpPIV5-GFP와 rpPIV5-PEDV S 바이러스 생성을 확인하였다. 이 재조합 바이러스 접종 후 세포변성효과 관찰, 역가 측정 및 성장곡선을 통하여 wild-type 바이러스와 유사한 감염성 및 증식성을 확인하였으며, 항원 특이적인 항체를 이용한 형광염색법을 통하여 재조합 바이러스의 외부 항원 단백질 발현을 증명하였다. 마지막으로 제작된 제조합 바이러스의 숙주동물내 면역형성 능력을 확인하기 위하여 rpPIV5-PEDV S 바이러스를 자돈에 접종하였다. 접종된 돼지로부터 혈청을 수거하여 PED 바이러스에 대한 중화시험을 수행한 결과 중화항체 형성을 확인할 수 있었다. 이를 통해 외부 항원 단백질 발현 재조합 바이러스가 pPIV5 기반 바이러스 벡터 백신 플랫폼으로써 다른 항원에 대응하여 면역반응을 유도할 수 있는 것을 확인하였다. 본 연구를 통하여 구축된 독자적인 pPIV5 벡터 시스템 기반 백신 플랫폼을 이용하여 향후 동물 감염병 뿐만 아니라 인수공통감염병을 포함한 신종 변종 인체 감염병을 효과적으로 제어할 수 있는 차세대 백신 개발에 적용 가능할 것으로 판단된다.

□ 연구결과의 활용계획
(1) 추가연구: 공격접종실험을 통한 바이러스 벡터 백신(돼지유행성설사 바이러스 스파이크 단백질 발현 재조합 바이러스)의 체계적인 효능 평가 연구 (2) 타 연구 응용: 구제역 예방을 위한 벡터 백신 개발 연구, 기타 국가 재난형 감염병 예방 백신 개발 연구 (3) 특허출원: 돼지 파라인플렌자 바이러스 5 기반 백신 (4) 국내외 전문 학술지에 논문 게재:돼지유행성설사 바이러스 스파이크 단백질 발현 재조합 pPIV5 백신 면역원성 평가, 돼지유행성설사 바이러스 스파이크 단백질 발현 재조합 pPIV5 백신 효능 평가 (5) 국내외 학회 학술발표: 돼지유행성설사 바이러스 스파이크 단백질 발현 재조합 pPIV5 백신 개발, 국내 양돈장 및 종돈장 pPIV5 모니터링 및 항체형성율에 관한 연구

( 출처 : 요약문 5p )

Abstract ▼

□ Purpose&contents
The purposes of this research proposal is to construct a reverse genetic system (full-length infectious cDNA clone) using pPIV5 isolated in Korea and to establish a vaccine platform in order to explore its application to develop a viral vector system expressing the viral protei

□ Purpose&contents
The purposes of this research proposal is to construct a reverse genetic system (full-length infectious cDNA clone) using pPIV5 isolated in Korea and to establish a vaccine platform in order to explore its application to develop a viral vector system expressing the viral protein antigen. The specific contents of the research are as follows: (1) Molecular and genetic studies on pPIV5 by determining its complete genome sequences (2) Animal studies to define pathogenicity of pPIV5 (3) Seroprevalence of pPIV5 in domestic pig farms (4) Development of a reverse genetic system for pPIV5 (5) Studies on in vitro characterization of cloned pPIV5 in cultured cells (6) Generation of recombinant pPIV5 expressing foreign antigens using pPIV5-reverse genetics (7) Studies on in vitro characterization of recombinant pPIV5 in cultured cells (8) Animal studies to investigate immunogenicity of rpPIV5

□ Result
We isolated porcine parainfluenza virus 5 (pPIV5) from the lung of a piglet in immortalized porcine alveolar macrophage (PAM) cells, named KNU-11. Nucleotide sequencing study revealed that the genome of pPIV5 has no predicted start and stop codons of SH gene, indicating that disruption of the open reading frame would likely lead to a lack of SH gene expression by KNU-11 and that the SH protein is non-essential for pPIV5 replication. Our study demonstrated that pPIV5 could efficiently infect and produced in high titers in host cells, causing notable cytopathic effects (CPE). In addition, the virus has hemagglutination in red blood cells, and pPIV5 infection regulated the transcriptional regulation of inflammatory cytokines/chemokines in PAM cells. Moreover, in vivo studies showed that pPIV5 did not cause any typical illness in infected pigs, while the pigs efficiently develop neutralizing antibodies against pPIV5 in the natural host. These result indicated that pPIV5 could be an effective viral vector candidate.

Therefore, we established a plasmid-based reverse genetics system by constructing the full-length pPIV5 infectious cDNA clone. To obtain pPIV5 infectious virus, the pPIV5 cDNA clone was transfected into the BHK cells and the culture supernatant was subsequently infected in PAM cells thereby rescued infectious cloned pPIV5. The infectivity and productivity of cloned pPIV5 was confirmed by monitoring CPE and immunofluorescence assay (IFA). Furthermore, the virus titration and growth kinetics for cloned pPIV5 were comparable to those of parental pPIV5. We then tried to generate the recombinant pPIV5 expressing foreign genes by replacing the ORF of SH gene with that of GFP or PEDV spike (S) protein, and the resulting clones were named rpPIV5-GFP and rpPIV5-PEDV S. We demonstrated the infectivity and productivity of those recombinant pPIV5 by CPE observation, virus titration, and growth kinetics, and also confirmed the expression of foreign gene in recombinant pPIV5-infected cells by IFA. We further investigated humoral immunity of rpPIV5-PEDV S in pigs and found that the rpPIV5-PEDV S virus efficiently produced neutralizing antibodies against PEDV in inoculated pigs. Our data indicated that pPIV5-based recombinant virus expressing a foreign antigen could induce robust immune response against the viral antigen. Therefore, as the viral vector vaccine platform, our novel pPIV5-based viral vector could be used as a vaccine platform for developing second-generation vector vaccines to efficiently control and prevent animal or zoonotic emerging or re-emerging viral diseases.

□ Expected Contribution
(1) Future research: Evaluation studies on efficacy of a viral vector vaccine (recombinant pPIV5 expressing the porcine epidemic diarrhea virus spike protein) in neonatal piglets challenged with virulent PEDV (2) Application on other research proposals: Development of a pPIV5-based viral vector vaccine for FMD prevention, Development of second-generation vaccines for the control of emerging or reemerging viral infectious diseases (3) Patent application: Porcine parainfluenza virus 5-based vaccines (4) Publication on research articles: Evaluation on immunogenicity of recombinant pPIV5 expressing the porcine epidemic diarrhea virus spike protein in pigs, Efficacy of recombinant pPIV5 expressing the porcine epidemic diarrhea virus spike protein in piglets against PEDV infection (5) Presentations at scientific conferences: Development of recombinant pPIV5 expressing the PEDV S protein, Epidemiological monitoring to investigate prevalence of pPIV5 in Korean pig farms

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 3연구계획 요약문 ... 4연구결과 요약문 ... 5 한글요약문 ... 5 SUMMARY ... 6연구내용 및 결과 ... 7 1. 연구개발과제의 개요 ... 7 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 13 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 26 5. 연구결과의 활용계획 ... 29 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 30 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 31 8. 참고문헌 ... 32 9. 연구성과 ... 34 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 40 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 40 12. 기타사항 ... 40별첨1 ... 41별첨2 ... 52끝페이지 ... 55