보고서 정보
주관연구기관 |
농림수산검역검사본부 |
연구책임자 |
문진산
|
참여연구자 |
허은정
,
박현정
,
김지호
,
김영조
,
윤하정
,
박경진
,
고은경
,
위성환
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2011-12 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
농림수산식품부 |
사업 관리 기관 |
농림수산검역검사본부 |
등록번호 |
TRKO201400003739 |
과제고유번호 |
1545003201 |
사업명 |
2011 수의과학기술개발연구 |
DB 구축일자 |
2014-05-07
|
키워드 |
축산가공품.정량분석법.L. monocytogenes.MRA.Listeria monocytogenes.Quantitative real-time PCR.Standard curve.Ready-to-eat sausage Livestock Processed Products.Prevalence QMAR.ALOP.FSO.PO.MC.sampling plans.
|
초록
▼
5. 최종 연구결과 요약
◦제1세부과제명 : 축산식품의 L. monocytogenes 정량검사법 확립에 관한 연구
1. 육가공품 및 유가공품에 L. monocytogenes 인공접종 후 균수 측정
- 표준균주 L. monocytogenes (ATCC 19115)를 37℃에서 24시간 배양하고 균수를 측정한 결과 2.0~3.0x109cfu/㎖ 이었음
- 리스테리아 음성의 소시지류, 햄류 등 육가공품 시료 및 분유, 우유 등 유가공품 시료 10g 또는 10㎖을 6개 준비하여 stomacher b
5. 최종 연구결과 요약
◦제1세부과제명 : 축산식품의 L. monocytogenes 정량검사법 확립에 관한 연구
1. 육가공품 및 유가공품에 L. monocytogenes 인공접종 후 균수 측정
- 표준균주 L. monocytogenes (ATCC 19115)를 37℃에서 24시간 배양하고 균수를 측정한 결과 2.0~3.0x109cfu/㎖ 이었음
- 리스테리아 음성의 소시지류, 햄류 등 육가공품 시료 및 분유, 우유 등 유가공품 시료 10g 또는 10㎖을 6개 준비하여 stomacher bag에 각각 넣은 후 fraser broth 49㎖ 분주한 다음 증류수에 단계별(6단계; 100~105cfu/㎖)로 희석한 균배양액 1㎖를 접종하여 stomacher로 균질화한 후 균수를 측정한 결과 3.0x104cfu/㎖에서 >1.0cfu/㎖으로 조사됨
2. RT-PCR을 위한 primer set 제작 및 민감성·특이성, 검출한계 검사
- L. monocytogenes internalin A gene에 대하여 여러 혈청형을 동시에 검출할 수 있는 primer-probe set 제작 후 각 혈청형별로 적용한 결과 모두 증폭됨
- 다른 Listeria spp. 6종 (L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri,L. murrayi, L. selshimeri, L. grayi)에 대하여 적용한 결과 모두 음성이었음
- 기존 primer 및 probe set의 검출한계 측정을 위하여 L. monocytogenes 각 혈청형 1 cfu/㎖에 대하여 RT-PCR을 적용한 결과 모두 검출됨
3. 육가공품 RT-PCR을 이용한 정량적 표준 검량 곡선(standard curve) 작성
- 소시지류, 햄류, 분쇄가공육류, 건조저장육류(육포)에 L. monocytogenes 인공접종 후 real time PCR법에 의한 정량적 표준 검량곡선 작성을 위하여 stomacher로 균질화한 시료 1㎖를 EP tube에 분주한 후 DNA를 추출하고, 나머지 액은 37℃에서 3시간동안 배양 후 다시 1㎖ 씩 EP tube에 분주한 후 DNA를 추출함
- 곧 바로 DNA를 추출하여 RT-PCR을 실시한 결과 104 cfu/㎖부터 101cfu/㎖까지 검출되었으며, 3시간 동안 추가적으로 배양한 샘플에 대하여 real time PCR을 실시한 결과 최대 104cfu/㎖부터 최소 100cfu/㎖까지 양호한 검출곡선을 나타내었으며, 소시지, 햄, 분쇄육, 육포, 분유, 우유 샘플에 대한 검출 상관식은 각각 Y=-3.1224X+41.1911 (R2=0.9911), Y=-3.1063X+44.705 (R2=0.9974), Y=-3.224X+43.005 (R2=0.9981), Y=-2.894X+42.185 (R2=0.9999)으로 조사됨
4. 유가공품 RT-PCR을 이용한 정량적 표준 검량 곡선(standard curve) 작성
- 조제분유류, 조제우유류 및 치즈류에 L. monocytogenes 인공접종 후 위의 육가공품에서 실험한 방법대로 DNA를 추출함
- 곧 바로 DNA를 추출하여 RT-PCR을 실시한 결과 104cfu/㎖부터 102 ∼101 cfu/㎖까지 검출 되었으며, 3시간 동안 추가적으로 배양한 샘플에 대하여 real time PCR을 실시한 결과 최대 104 cfu/㎖부터 최소 100cfu/㎖까지 양호한 검출곡선을 나타내었으며, 분유류, 우유류, 치즈류 샘플에 대한 검출 상관식은 각각 Y=-3.505X+43.791 (R2=0.9974), Y=-3.204X+45.066
(R2=0.9973) 및 Y=-3.073X+39.793 (R2=0.9926)으로 조사됨
5. 축산가공식품 적용 시험
- 판매점(대형 마트 등)에서 유통중인 축산가공품에 대한 모니터링 검사
- 총 402 시료(햄류 129건, 소시지 95건, 분쇄가공육 72건, 치즈 54건, 가공유 42건, 분유 10 건) 중 햄 5건(3.9%), 소시지 3건(3.2%)에서 양성반응을 보임
- 각각의 standard curve를 이용하여 정량한 결과 모두 10< cfu/g 사이였음
◦제2세부과제 : 축산가공품의 L. monocytogenes 오염 특성 조사
1. 시료채취 계획 수립
- 국내외 문헌 조사를 통하여 유가공품류 중에서 L. monocytogenes 검출 가능성이 높은 치즈류 및 아이스크림류를 포함하여 유가공품 유형을 감안하여 총 500건의 시료채취 계획 수립
2. 유가공품 및 알가공품에서의 L. monocytogenes 검사 결과
- 우유류 22건, 저지방우유류 8건, 유당분해우유 2건, 가공유류 57건, 발효유류 84건, 버터류12건, 자연치즈 80건, 가공치즈 88건, 조제유류 17건, 아이스크림류 83건, 유크림류 6건, 기타 4건을 포함하여 총 463건의 시료에 대하여 L. monocytogenes 오염실태를 조사한 바, 검출된 시료는 한건도 없었음
- 전란액 27건, 알가형성형제품 5건, 염지란 17건, 피단 1건을 포함하여 총 50건의 알가공품에 대하여 L. monocytogenes 오염 실태를 조사한 바, 양성으로 검출된 시료는 한건도 없었음,
3. 치즈류에서의 L. monocytogenes 생육 예측 모델 개발
- 자연치즈와 가공치즈의 제품에 대하여 L. monocytogenes 초기오염 농도를 2-3log cfu/g 수준으로 인공적으로 접종시킨 후 4, 7, 15, 25℃에 보관하면서 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96시간 이후 1-2일 간격으로 균수를 측정하여 생육 변화를 측정한 바, 25℃에 보관중인 치즈의 경우 모두 24시간 이내에 2log cfu/g 이상 증식한 반면, 4℃와 7℃에 보관된 치즈의 증식 변화는
미미한 것으로 조사됨.
◦제3세부과제 : 축산가공품의 L. monocytogenes 정량적 위해평가 모델 개발
1. 햄류/소시지류에 대한 L. monocytogenes 노출평가
- 햄 및 소시지류 총 1,245 시료에 대한 분석결과 (2011년 농림수산검역검사본부)를 바탕으로 Cumulative 분포를 적용하여 생산완료시점으로 기준으로 햄류는 최소 -1.3979, 최대 0.8716, 평균 -1.3891 ± 0.123 Log cfu/g, 소시지류는 최소 -1.3979, 최대 1.9084, 평균
-1.3701 ± 0.233 Log cfu/g으로 추정하였음.
- 유통/소비 환경요인 조사 및 확률통계학적 분석: 조사자료 및 문헌고찰을 통해 유통온도는 Logistic (11.5597,1.3693) 모델을 이용하여 평균 11.56, 최소 0, 최대 22℃로 하였고 판매시간은 최소 1일, 중위수 7일, 최대 25일로 하여 Pert 모델 적용
- 햄 및 소시지류에서의 L. monocytogenes에 대한 성장예측모델은 1년차 실험결과를 바탕으로 Gompertz 모델에 적용하여 활용
2. 유해 특성(hazard and risk characterization) 조사
- 햄, 소시지류에 대한 섭취량 및 섭취빈도는 2009 국민 건강영양조사 자료를 이용 적정 확률분포모델(햄: Lognorm2(2.4162,1.1003), 소시지류 Lognorm2(3.0099,1.0765)로 추정하였고, 식중독 민감그룹인 영유아, 노인, 임산부, 환자군으로 구분하여 추정
- L. monocytogenes 관련 Dose-response 모델식은 외국에서의 사례가 많은 WHO/FAO (2001)의 Exponential model (P=1−Hexp(−Jr*N), r=2.37×10-14)을 활용
3. 위해평가용 Simulation model 개발
- 초기오염수준, 온도 및 시간 등 환경변수, 성장예측모델, 섭취량과 섭취빈도 및 양-반응모델을 포함하는 햄류와 소시지류 시뮬레이션 모델 개발
4. 위험(risk)수준 추정 및 시나리오 분석
- 햄류의 가열제품의 경우 국내에서 평균적으로 serving 당 L. monocytogenes에 의한 식중독발생 확률은 2.16x10-13로, 소시지류의 가열제품의 경우 국내에서 평균적으로 serving 당 L.monocytogenes에 의한 식중독 발생 확률은 1.81x10-12로경우 추정됨.
- 식중독 민간그룹별에 있어서는 환자군과 노인층이 위험성 높은 집단으로 추정됨
- 시나리오 분석결과 유통온도가 가장 중요한 인자로 나타남
5. 정량적 안전기준 및 관리기준 제시
- 시나리오 분석결과 Listeriosis에 대한 위해성과 관련한 국민건강보호와 식품산업체 발전을 동시에 만족시킬 수 있는 국가목표로서의 적정보호수준(Appropriate level of protection:
ALOP)은 10-11수준이 적정하다고 판단
- 상기의 ALOP를 만족하기 위한 소비시점에서의 식품안전목표(Food safety objective: FSO) 기준은 평균적으로 약 1 log cfu/g 수준으로 추정
- 최종적으로 이들 ALOP와 FSO 기준을 만족하기 위해서 식품산업체에서는 제조완료 시점에서 의 기준(Performance objective: PO)으로서 약 0.1 log cfu/g으로 이에 해당하는 시나리오 #2인 n=5, c=1, m=1 cfu/g, M=10 cfu/g로 관리되어야 할 것을 제안함
Abstract
▼
Title (1st subtitle) : Construction of standard curve for quantitative detection of Listeria monocytogenes in ready-to-eat sausages by real time PCR method
We constructed a standard curve to quantify Listeria monocytogenes in ready-to-eat product, especially sausage samples, using real-time PCR.
Title (1st subtitle) : Construction of standard curve for quantitative detection of Listeria monocytogenes in ready-to-eat sausages by real time PCR method
We constructed a standard curve to quantify Listeria monocytogenes in ready-to-eat product, especially sausage samples, using real-time PCR. A standard curve was generated using serially diluted L. monocytogenes cells in distilled water. When cells were artificially inoculated in 10g of sausage samples in 90 ㎖ buffered peptone water, the cell concentration of range was approximately 1.0×108 to 100 CFU/㎖. The standard curve of the serially diluted cells was linear for at least seven orders of magnitude from 103 to 10 9 CFU/㎖ of L. monocytogenes. When cells were diluted in sausages, the linearity range was from 104 to 108 CFU/㎖. The correlation coefficient (R2) of diluted cells was 0.9888 and the slope of the curve was -2.6621. The coefficient and slope of inoculated samples were 0.9916 and -2.747, respectively. The R2 value for serially diluted L. monocytogenes and artificially contaminated sausage samples were acceptable. The approach described in this study represents the potency of the quantification of L. monocytogenes in sausage samples by quantitative real-time PCR. It can be used in monitoring the presence and persistence of this pathogen in sausages.
Title (2nd subtitle) : Prevalence of Listeria monocytogenes Isolated from Livestock Processed Products in Korea
We investigated the prevalence of the Listeria monocytogenes from livestock processed products in processing plants and retail markets of Korea from 2010 to 2011. A total of 1,446 samples were collected; Meat processed products such as cooked ham and sausage, jerked meat, and grind meat products. Milk processed products such as milk, butter, cheese, and ice cream. Egg processed products such as whole egg liquid, pidan. L. monocytogenes were isolated from samples using listeria enrichment broth, fraser broth and Oxford agar, and counted in Oxford agar. The 8 of L. monocytogenes strains (1.58%) were isolated from sausages, 4 (0.77%) from mixed pressed ham and one (0.51%) from jerked meat, respectively. 11 samples were below 10 CFU/g. 2 samples were between 10 to 100 CFU/g. The ten isolates (76.9%) were 1/2b except three isolates (1/2a) in the serotypes. According to PFGE results, the isolates from same establishment was closely related. We can explain that transmission happen in same establishment following the procedure of the products.
Further studies are needed to understand the transmission route of L. monocytogenes, including a survey of food handlers, environments of retail markets, and all potential risk factors in cooked sausages, mixed pressed hams, and jerked meat processing.
Quantitative Microbial Risk Assessment of Listeria monocytogenes on Ham and Sausage Products in Korea
This study was conducted for quantitative microbial risk assessment (QMRA) of Listeria monocytogenes with consumption on ham and sausage products in Korea, according to Codex guidelines. Frame-work model as product-retail-consumption pathway composed with initial contamination level, the time and temperature in distributions, and consumption data sets for ham and sausage products and also used the published predictive growth and dose-response models for Listeria monocytogenes.
QMRA simulation model was constructed in an Excel spreadsheet. Exposure assessment consisted of three process steps (produced products, retail, and consumption as a post process) including a predictive growth model, a novel dose-response model, serving size, etc included for hazard characterization and risk characterization. In addition, the Normal distribution was used for the set up of MC (Microbiological Criteria) as two, three-class attribute plans. The developed model was simulated with @RISK. Totally 12 scenarios by sample plans were simulated with temperature at distribution and storage time etc. According to simulation results, in Korea the suggested reasonable PO (Performance objective) and FSO (Food Safety
Objective) were the level of Listeria monocytogenes with risk level was 10-11 (mean) as ALOP (Appropriate Level of Protection), and the MC also proposed n=5,c=1, m=1 cfu/g, M=10 cfu/g as three-class attributes plans at the point of production.
목차 Contents
- 총괄요약표 ... 1
- 연구과제 최종결과보고서 ... 4
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
- Ⅲ. 연구결과 ... 8
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 22
- Ⅴ. 고 찰 ... 24
- Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 27
- Ⅶ. 참고문헌 ... 28
- Ⅹ. 영문초록 ... 31
- 끝페이지 ... 33
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.