보고서 정보
| 주관연구기관 |
전남대학교
Chonnam National University |
| 보고서유형 | 최종보고서 |
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| 발행국가 | 대한민국 |
|---|
| 언어 |
한국어
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| 발행년월 | 2013-08 |
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| 과제시작연도 |
2012 |
| 주관부처 |
농림축산식품부
Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
| 등록번호 |
TRKO201400005733 |
| 과제고유번호 |
1545005271 |
| 사업명 |
생명산업기술개발 |
| DB 구축일자 |
2014-11-29
|
| DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400005733 |
초록
▼
○ 연구개발 목표 및 내용
1. 연구개발목표 : 건조봉독의 면역활성 효능과 세균 및 바이러스의 인공감염에 대한 항병력 효과를 검증하여 건조봉독을 이용한 가축의 면역증강제 및 전염병 예방제품을 개발하기 위함.
2. 연구개발내용
가. 봉독 가축질병치료제의 면역활성 효능검증
나. 봉독 가축질병치료제의 항병력 효과 검증
다. 유효성분의 물리화학적 성질 규명 및 지표성분의 보존 방법 개발
라. 봉독의 spray 제제개발과 마이크로캡슐화를 통한 서방형 제제개발
마. 봉독 가축질병치료 및 예방제의 제품화
○ 연구개발 목표 및 내용
1. 연구개발목표 : 건조봉독의 면역활성 효능과 세균 및 바이러스의 인공감염에 대한 항병력 효과를 검증하여 건조봉독을 이용한 가축의 면역증강제 및 전염병 예방제품을 개발하기 위함.
2. 연구개발내용
가. 봉독 가축질병치료제의 면역활성 효능검증
나. 봉독 가축질병치료제의 항병력 효과 검증
다. 유효성분의 물리화학적 성질 규명 및 지표성분의 보존 방법 개발
라. 봉독의 spray 제제개발과 마이크로캡슐화를 통한 서방형 제제개발
마. 봉독 가축질병치료 및 예방제의 제품화
○ 연구결과
1. 봉독 가축질병치료제의 면역활성 효능검증
가. 봉독의 성분별 안정화된 제형의 효능 비교
- 마우스에 봉독을 피하, 근육, 점안의 방식으로 적용한 결과 점안으로 수지봉독을 투여한 경우, CD4+/CD8+세포 비율의 증가와 라이소자임 활성의 유의성 있는 증가를 확인 할 수 있었다.
- 마우스에 봉독을 점안, 피하, 근육 투여 후에 간독성은 발생하지 않았음을 확인하였다.
나. 닭에서 봉독치료제의 면역 효과규명
- 닭에 스프레이 형식으로 적용하였을 때 대조군에 비해 비장에서 CD4+:CD8+ T 세포 비율의 유의적인 증가, IL-18과 IFN-γ의 상대적인 발현정도의 증가, 라이소자임의 활성이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 다. 돼지에서 봉독치료제의 면역효과 규명
- 봉독을 이유자돈의 주둥이 부위와 미근부에 주사한 군에서 대조군에 비해 체중 증가, 혈중 라이소자임의 활성 증가, CD4+/CD8+ ratio의 증가 및 IFN-gamma level의 증가에 유의적인 효과를 확인하였음.
- 이유자돈에서 면역증강 효과는 봉독 1회 주사 시 최대 7일까지 그 효과가 지속되었다.
라. 송아지에서 봉독치료제의 면역효과 규명
- 봉독을 송아지 피하 접종군에서는 대조군에 비해 혈중 라이소자임의 활성 증가, IL-12 및 IFN-gamma level의 증가에 유의적인 효과가 있었음.
- 송아지의 면역증강 효과는 정제 봉독 1회 주사 시 최대 12일까지 그 효과가 지속되었음.
마. 돼지에서 서방형 봉독치료제의 면역효과 규명
- 서방형 봉독 미근부 부위 접종군은 대조군에 비해 CD4+:CD8+ ratio의 증가 및 IFN-gamma level의 증가, IL-12 level의 증가, IL-4 level의 감소에 유의적인 효과가 있는 것을 확인하였다.
- 이러한 효과는 일반 봉독의 경우 최대 7일까지만 그 효과가 지속됐으나, 서방봉독의 경우 최대 14일까지 그 효과가 지속되어 일반봉독에 비해 더 오랫동안 면역증강효과를 나타내는 것을 확인하였음.
2. 봉독 가축질병치료제의 항병력 효과 검증
가. 봉독을 이용한 닭의 세균성(살모넬라) 장염예방 및 치료 효과 검증
- 봉독을 스프레이한 닭에 살모넬라를 공격 접종한 후, 면역지표들이 활성화 되었으며 병변의 감소 및 살모넬라 분리 및 분비가 감소됨을 확인함
- 봉독 처치군에서는 체중의 증가, 폐사율의 감소, 살모넬라에 의한 병변 정도의 감소, 간, 비장, F낭에의 살모넬라분리율의 감소를 확인하였음
- 비장에서 CD4+:CD8+ T 세포 비율의 유의적인 증가, IL-18과 IFN-γ의 상대적인 발현정도의 증가, 라이소자임의 활성이 유의적으로 증가함을 확인하였음
나. 봉독을 이용한 돼지의 세균성(살모넬라) 장염 예방 및 치료효과 검증
- 봉독을 이유자돈에 피하에 투여 후, 살모넬라에 인공 감염 시켰을 때 대조군에 비해 분변의 설사 정도나 세균의 수 (분변, 회장, 장간막림프절)가 감소함을 확인하였음.
- 면역학적으로 IFN-γ의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인 할 수 있었음.
다. 봉독을 이용한 돼지의 소모성 바이러스(PCV-2와 PRRS) 질환 예방 및 치료효과 검증
- 봉독을 이유자돈의 주둥이 부위와 미근부에 투여한 후 PCV2와 PRRS 바이러스를 공격 접종하였을 때, 대조군에 비해 혈중 라이소자임의 활성 증가, CD4+:CD8+ ratio의 증가 및 IFN-gamma 및 IL-1β level의 증가에 유의적인 효과가 있었음.
- 특히 미근부 주사군의 경우 혈중 또는 표적 장기인 폐, 림프절, 편도, 가슴샘에서 PRRSV수가 유의적으로 감소하였음.
라. 봉독을 이용한 송아지의 세균성(대장균, 살모넬라) 및 바이러스성(로타바이러스, 코로나바이러스)설사 치료 효과 검증
- 봉독을 송아지 피하에 투여후 살모넬라, 용혈성 대장균 및 소로타바이러스, 소코로나바이러스를 공격 접종 하였을 때, 봉독을 주사한 군에서 대조군에 비해 IFN-gamma 및 IL-12 level의 증가와 같은 면역학적 지표의 증가를 확인 할 수 있었음.
- 대조군에 비해 봉독 투여군에서 분변의 수분함량이 감소하였으며 분변 내 접종한 병원체의 배출량이 감소하였음.
마. 서방형 봉독을 이용한 돼지의 세균성(살모넬라) 장염 예방 및 치료효과 검증
- 서방형 봉독을 이유자돈 미근부에 투여한 후에 살모넬라를 공격 접종 하였을 때, 서방봉독투여군에서 대조군에 비해 항병능과 관련된 여러 가지 지표들이 활성화되었음.
- 설사정도의 감소 및 IFN-gamma level의 증가, IL-12 level의 증가, IL-4 level의 감소, 분변 및 표적 장기에서의 살모넬라수 감소에 유의적인 효과가 있었음.
- 일반봉독 투여군에 비교하여 서방형 봉독 투여군에서 항병능력이 더 효과적으로 강화되는 것을 확인하였음.
3. 유효성분의 물리화학적 성질 규명 및 지표성분의 보존 방법 개발
- SDS-PAGE, 2차원 전기영동, isoelectric focusing 분석법을 수행하여 건조봉독과 생봉독의 protein profile을 비교하였음.
- 주요 봉독 단백질로 알려진 hyaluronidase, phospholipase A2 및 melittin의 함량 변화를 전기영동법으로 분석할 경우, 유의한 차이를 보이지 않았음.
- 상기 3종류의 서로 다른 전기영동법을 이용하여 봉독단백질을 분리하고 주요 단백질 114종을 질량분석법으로 분석하여 102개의 단백질을 동정하였음.
- 생봉독 특이 단백질을 ESI-LC-MS/MS를 이용하여 질량분석법으로 분석한 결과, serine carboxylpeptidase, venom dipeptidyl peptidase 4, carboxylesterase-6, venom serine protease 34는 생봉독에만 존재하는 단백질이었으며, 이들에 의한 봉독의 가수분해가 발생함을 시사하고 있음.
- 이를 해결하기 위해 나노구조체에 의한 단백질의 분해 억제 방법을 고안하였음.
- 모델시스템과는 달리 나노구조체를 활용한 봉독의 안정화방법은 만족할 만한 효과를 얻지못하였음.
- 건조봉독과 생봉독에 대한 pH 안정성 실험 결과, 봉독의 채집 및 정제공정에서 시료의 pH를 3 내지 4로 유지시키면 봉독단백질의 가수분해를 억제할 수 있음을 확인하였음.
- 4종류의 액상제형에 대해 각각 3로트에 대한 장기보존시험, 가속시험, 가속시험을 수행하였음.
- RP-HPLC에 의한 안정성 시험시료의 분석 결과, 제형2의 안정성이 가장 높았으며, 제형1의 안정성이 가장 낮았음.
- SDS-PAGE, 2차원 전기영동, isoelectric focusing, RP-HPLC, SEC-HPLC, 단백질 정량법을 개발하였으며, 제2협동, 제3협동과제의 연구과정 중 발생한 단백질의 물리화학적 제반 문제들에 대한 정보제공,
- 미지의 단백질에 대한 동정 및 분석지원업무를 지속적으로 수행하였음.
4. 봉독의 spray 제제개발과 마이크로캡슐화를 통한 서방형 제제개발
가. 봉독제형 제조를 위한 제조환경에 따른 안정성 측정
- 멜리틴 함량이 약 52% 나옴. 총 10분간 약 5%의 멜리틴 함량 감소가 일어남. dichloromethane (MC)에 봉독을 넣으면 멜리틴 농도 감소가 나타남. Sonication과 유기용매(dichloromethane)에 대한 단백질 함량 감소 나타남. 멜리틴의 경우 원래 함량(40~50%) 값이 증류수에서 얻어졌으며 산성조건(0.1N HCl)에서는 거의 비슷한 값이 얻어졌으나 염기성 조건(0.1N NaOH)에서는 93%이상 감소한 값이 얻어졌음. 멜리틴은 산성용액에서 안정. 염기성에서는 불안정. 봉독은 50, 70, 100% 에탄올에는 불용성이었다. 대부분의 첨가제들에서 봉독 내 멜리틴 함량의 변화는 거의 없었다. 고 농도 봉독 용액은 희석과 filtering에 대해 영향을 받지 않는다. 4℃, 차광 조건에서 28일 까지는 봉독 내 멜리틴 함량 변화가 없음. 4℃, 차광 조건에서 28일 이후 봉독 내 멜리틴 함량은 감소하기 시작.
나. 봉독 spray 제형 연구
- 모든 제형은 봉독 농도 10 mg/ml를 목표로 4개의 제형 (Formular 1,2,3,4)을 제조하였음.
- Formular 1은 고분자인 HPMC를 주 기제로 하여 제조하였음.
- Formular 2는 과당과 포도당을 점조제로 사용하여 제조하였음.
- Formular 3은 Formular 1과 2를 접목하여 제조하였음.
- Formular 4는 sucrose를 고농도로 사용하여 제조하였음.
다. 봉독 spray 제형의 안정성 평가
- 각각의 실험의 실행 시간은 0일, 1주, 2주, 4주, 8주로 하였다.
- 멜리틴 함량 실험: 2달의 기간 동안 각 제형들의 멜리틴 함량은 거의 변화가 없었다.
- 용제 및 제형 pH: 봉독을 제외한 용제의 pH는 전부다 pH 6이하의 산성으로 유지되었다.
- 용제 및 제형 점도: 순수 봉독 용액과 F 1 제형의 점도는 거의 변화가 없다. F 2~4 제형의 점도가 2 주가 지난 뒤 유의한 감소를 나타내었다.
- 납·비소 한도 시험: 납 시험은 장기보존시험기간 동안 5ppm 미만으로 적합하였다. 비소시험은 장기보존시험기간 동안 3ppm 미만으로 적합하였다.
- 중금속 시험: 모든 제형에 중금속이 없다는 것으로 판단됨.
- 미생물 한도 시험: 생균수 시험 (일반세균)에서는 시험 기간 중 어느 페트리접시에서도 일반세균의 군집이 발견되지 않았다. 생균수 시험 (진균)에서는 시험 기간 중 어느 페트리접시에서도 진균의 군집이 발견되지 않았다. 특정 미생물 시험 (녹농균, 대장균, 살모넬라, 황색포도상구균)에서는 시험 기간 중 어느 페트리접시에서도 특정미생물의 군집이 발견되지 않았다.
- SDS-PAGE를 이용한 봉독 내 멜리틴과 phospholipase A2: 시험기간 동안 각각의 제형에서 봉독의 가장 많은 함량을 차지하는 phospholipase A 2와 melittin을 각 제형에서 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 멜리틴 용출 시험: Formular 1은 2달간 서방출의 경향을 보여주었다. 이것은 HPMC에 의한 점도 증진의 효과로 판단됨. Fomulation 2, 3, 4는 10분 안에 대부분의 봉독이 용출되는 것이 관찰되었다. 제형의 삼투압이 높아 빠른 확산과 용출에 의한 결과라 판단됨.
- MTT test를 이용한 세포 독성 시험: 봉독이 포함되지 않은 용제에서만의 세포독성을 살펴보면 F 2 제형이 다른 제형들 보다 세포독성이 적다고 판단됨.
라. 봉독 봉입된 서방형 입자 연구
- Sucrose를 사용한 입자가 사용하지 않은 입자보다 봉입률이 조금 높았다.
- Sucrose에 의한 봉입률 상승 효과는 sucrose가 입자 제조 과정 동안 membrane bilayer의 파괴를 막는 membrane protecting 효과를 갖기 때문에 발생한다고 판단됨.
- Sucrose를 사용한 입자는 90% 이상의 yield값을 가졌다.
- 지금까지 실행된 실험을 전체적으로 보면 둘 다 높은 yield 값을 가졌다고 판단됨.
- VC 1과 VC 2 비슷한 drug loading 값을 가졌다.
- 이것은 VC 1이 봉입률도 높지만 yield값도 높아서 drug loading을 계산하는 공식에서 분모, 분자 모두 커서 발생한 결과라 판단됨.
- 이 최적화된 PLGA 입자는 전남대로 보내어져 동물실험이 진행되어 3~4주 정도 봉독의 효능을 나타낸 다는 것을 확인하였다.
5. 봉독 가축질병치료 및 예방제의 제품화
- 일체형 봉독 채집 장치를 제작하여 봉독을 대량 생산하였으며 이로부터 새롭게 얻은 봉독의 성분들을 분리 동정하여 구명하였음.
- 기존의 개발된 봉독은 주성분인 melittin만을 지표로 하여 제품화 하였지만 ㈜비센은 봉독의 수용성 물질과 지용성물질을 일정비율 함유하는 봉독(수지봉독)을 제조하여 이 원료로부터 특별히 동물의 면역기능을 증강시키는 분획을 선정하였으며, 봉독의 성분들에 대한 분석방법을 확립하였음.
- 특별히, 기존에는 시도되지 않았던 봉독의 비 단백 분획으로부터 지용성 물질들인 11(Z)-eicosen-1-ol, Chrysin 및 Pinocembrin 등의 구조를 동정하여 규명하였음. 그 밖에 봉독 효소들의 활성 측정을 통해 봉독의 생물활성 검정을 위한 기시법을 확립하였음.
- 육계의 면역기능을 활성화 시켜 항병력을 갖는 제품을 제조하기 위하여 산제의 형태의 시제품을 제작하여 임상시험 신청단계에 있으며 제품은 가금류의 면역 증강제 “아피칙스”로 시판하기 위해 상표등록 되었음.
- 닭 이외의 돼지(아피돈스) 및 소(아피우스)에 대한 상표출원도 완료되었음.
- 그 밖에 소, 돼지 등의 면역증강제로서 PLGA코팅 제제에 대한 제품등록을 위한 추가적인시험(사양시험 등)은 현재 많은 비용이 발생될 것으로 추정 되어 이를 별도로 수행 할 수 있는 방법을 모색 중임.
○ 연구성과 활용실적 및 계획
-제 1협동과제의 연구성과로 특허 봉독단백질의 안정성 증진방법(출원번호 10-2013- 0095787)를 출원하였음.
-제 2협동과제의 연구 성과로 '봉독을 함유한 생분해성 고분자 미립구 및 이의 제조방법' 에 대한 특허를 출원(출원번호: 10-2013-0097353)하였으며 2012년 춘계약학회 (제주) 및 추계약학회(서울)에서 “Preparation and characterization of melittin-loaded gelatin nanoparticles microspheres made by nanoprecipitation”과“Preparation and Characterization of bee venom Loaded Microparticles by Precipitation”라는 제목의 연구결과를 발표하였음. 또한 더욱 진행된 연구결과를 2013년 춘계약학회 (순천)에서 Preparation and characterization of bee-venom-loaded PLGA nano/Microparticle라는 제목의 연구결과를 발표하였음.
-제 3협동과제의 연구 성과를 바탕으로 특허 등록 일벌의 생물학적 공격성을 유도하여 다량의 봉독을 효율적으로 채집 할 수 있도록 하는 봉독채집기로 특허출원(출원번호 10-2012-0066198) 및 등록(KP10-1240291)하였으며, 면역증강 봉독조성물 및 그제조방법(10-2010-0130671), 증체율 및 면역기능이 향상된 봉독조성물(10-2012-0069221), 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법(출원번호: 10-2012-0065718)에 대한 특허를 출원하였고, 2011년 아르헨티나에서 개최된 세계양봉대회에서 Pulsed electric field(PEF)-treated bee venom has different activities both in vitro and vivo와 Comparison the protein decomposition of honeybee venom in different collecting methods 제목으로 학술 발표함.
- 제 1세부 과제의 연구성과로 Journal of Veterinary Medical Science 저널(SCI급)에 논문을 발표하였음 (논문 제목: Immunoprophylactic Effects of Administering Honeybee (Apis melifera) Venom Spray against Salmonella Gallinarum in Broiler Chicks.)
- 현재 SCI급 논문 1편은 투고 중(논문제목: Immunomodulatory effect of honeybee (Apis melifera) venom on pig immune systems and its antiviral activity against porcine reproductive and respiratory syndrome virus)에 있으며 그 외 2편은 준비 중에 있어 총 4편의 SCI급 논문이 발표될 예정임.
- 2013년 9월 25일부터 9월 28일까지 대구에서 개최되는 국제축산박람회에 참가하여 본 연구에서 확인된 봉독의 효능을 축산농가에 홍보함으로써 제품출시에 따른 매출로 이어질 수 있도록 준비 중이며 동시에 본 박람회를 통해 축산시장에 대한 규모, 품목, 경쟁제품 등에 대한 정보를 구체적으로 확보하여 마케팅 전략 수립에 활용하였음.
- 2013년 9월 26일부터 10월 4일까지 우크라이나 키예프에서 개최되는 세계양봉대회에 참가하여 지금까지의 연구성과 및 제품화에 대한 전략 수립에 활용하였음.
- 이 과제를 통해 확인한 봉독 스프레이에 의한 닭에서의 면역증강효과와 항병력효과 결과를 이용하여 닭의 면역증강 및 항병력 증강제제 (상품명: 아피칙스)를 개발하여 현재 제품등록을 진행 중임. 또한 돼지에 적용한 서방형 제제는 지속적인 효과가 유지됨을 확인하였으며, 이 결과를 토대로 차별화 된 제품으로 개발할 계획임.
Abstract
▼
Ⅳ. Results of Research and Development
1. Analysis of Korean honey bee venom on immune enhancing effect as a industrial animal therapeutic agent
A. Comparison of Korean honey bee venom components on immune activation (the prophylatic effects in mouse model)
- Korean bee venom was administra
Ⅳ. Results of Research and Development
1. Analysis of Korean honey bee venom on immune enhancing effect as a industrial animal therapeutic agent
A. Comparison of Korean honey bee venom components on immune activation (the prophylatic effects in mouse model)
- Korean bee venom was administrated to mouse as subcuteanous (SC), imtramuscular (IM) or ocular way, respectively, and ocular group showed that CD4+/CD8+ ratio and lysozyme activity were significantly increased compared to those of control group.
- Liver toxic effect was not observed in SC, IM and ocular group.
B. Analysis of prophylactic and production stimulating effect of Korean honey bee venom on chicks
- Korean honey bee venom was administrated using spray method to chicks and significant increased was observed in CD4+/CD8+ ratio, relative mRNA expression level of IL-18 and IFN-γ and lysozyme activity.
C. Analysis of prophylactic effect of honey bee venom on pigs
- Korean honey bee venom was administrated as snout and tail base route in pig and significant increase was observed in body weight, CD4+/CD8+ ratio, relative mRNA expression level of IFN-γ and lysozyme activity.
D. Analysis of prophylactic effect of Korean honey bee venom on calves
- Korean honey bee venom was administrated as subcuteanous way to neck region in calves. Significant increase was observed in relative mRNA expression level of IFN-γ and lysozyme activity.
E. Analysis of prophylactic effect of PLGA coated Korean honey bee venom on pigs
- PLGA coated Korean honey bee venom and non-PLGA coated Korean honey bee venom were injected to tail base region, which is the optimal injection route for bee venom as revealed in former study, in pig for the demonstration of immune boosting effect.
- Significant increase was observed in CD4+/CD8+ ratio and relative mRNA expression level of IL-12 and IFN-γ, and also, relative mRNA level of IL-4 was markedly decrease in bee venom injection group.
- These immune enhancing effect prolonged until 14 days after injection of PLGA Korean honey bee venom in pigs. While, immune enhancing effect persisted only 7 days in non-PLGA Korean honey bee venom group.
2. Analysis of Korean honey bee venom on antimicrobial and antiviral effect as a industrial animal therapeutic agent
A. Analysis of the antimicrobial effects of honey bee venom against chick Salmonellosis
- Korean bee venom was administrated using spray method to broiler chicks and then Salmonella Gallinarum was infected via oral route. After the infection, a variety of immunological and antimicrobial status was evaluated. Significant increase was observed in body weight, CD4+/CD8+ ratio, relative mRNA expression level of IL-18 and IFN-γ and lysozyme activity.
- Also, mortality rate, clinical symptoms and bacterial counts in liver, spleen and bursa were also markedly decreased in bee venom spray group.
B. Analysis of the antimicrobial effects of honey bee venom against pig Salmonellosis
- Korean honey bee venom was injected to pig and then Salmonella Typhimurim was infected via oral route. After the infection, a variety of immunological and antimicrobial status was evaluated.
- Significant increase was observed in relative mRNA expression level of IFN-γ. Also, severity of diarrhea and bacterial counts in feces, ileum and mesenteric lymph node were also markedly decreased in bee venom group.
C. Analysis of the antiviral effects of honey bee venom against porcine postweaning multisystem wasting syndrome (PMWS) related porcine circovirus type 2(PCV-2) and porcine reproductive and respiratory(PRRS) virus
- Korean honey bee venom was administrated as three separate way, snout, neck, and tail base route to pig, and then PMWS related PCV-2 and PRRS virus were infected via respiratory route.
- Significant increase was observed in body weight, CD4+/CD8+ ratio, relative mRNA expression level of IL-1β and IFN-γ and lysozyme activity in snout group and tail base group.
- The PRRSV and PCV2 viral titer were also highly reduced in lung, bronchial lymph node, thymus and tonsil.
- Therefore, snout and tail base route is the best way to injection of Korean honey bee venom in pigs for the acquirement of immune enhancing effect and anti-viral effect.
D. Analysis of the antimicrobial and antiviral effects of Koran honey bee venom against bacterial pathogen (Enterohemolytic Escherichia coli and Salmonella Typhimurium) and viral pathogen (bovine rota virus and bovine corona virus) in calves
- Korean honey bee venom was administrated as subcuteanous way to neck region in calves, and then bacterial pathogen (Enterohemolytic Escherichia coli and Salmonella Typhimurium) and viral pathogen (bovine rota virus and bovine corona virus) were infected via oral route.
- Significant increase was observed in IL-12 and IFN-γ. Also, severity of diarrhea and bacterial counts and viral titer in feces were also markedly decreased in bee venom group.
E. Analysis of the antimicrobial effects of PLGA coated bee venom against pig Salmonellosis
- PLGA coated Korean honey bee venom and non-PLGA coated Korean honey bee venom were injected to tail base region, which is the optimal injection route for bee venom as revealed in former study, and then Salmonella Typhimurim was infected via oral route.
- Significant increase was observed in CD4+/CD8+ ratio and relative mRNA expression level of IL-12 and IFN-γ, and also, relative mRNA level of IL-4 was markedly decrease in bee venom injection group.
- Also, severity of diarrhea, bacterial counts in feces and Salmonella target organ, such as liver, spleen and cecum were also markedly decreased in PLGA coated Korean honey bee venom group. While, non-PLGA bee venom group only showed partial immnue enhancing effect and anti-microbial effect compared to PLGA coated bee venom group.
- Therefore, PLGA coated bee venom might more better candidate for the therapeutic agent for the anti-Salmonellosis and other microbial diseases.
3. Stabilization and standardization of Korean honey bee venom protein
A. Physicochemical characterization of bee venom protein
- Physico-chemical properties of bee venom proteins have been characterized in order to minimize the inactivation and loss of functional molecules in bee venom during the preparation and purification.
- The 3 different types of electrophoretic methods, SDS-PAGE, isoelectric focusing and 2-dimensional electrophoresis, had been performed and optimized to compare the protein profiles between naive and dried bee venom.
- The levels of major proteins of bee venom, hyaluronidase, phospholipase A2 and melittin, have not been significantly changed during dry and purification process.
- Total 114 protein spot have been analyzed by LC-MS/MS, which identified 102 proteins successfully.
- The function of naive bee venom-specific protein have been searched, which could lead us to develope novel preparation and purification methods for extended stability. The data have shown that several kinds of protease, serine carboxylpeptidase, venom dipeptidyl peptidase 4, carboxylesterase-6, and venom serine protease 34, were found exclusively in naive bee venom, which implied those protease could digest and/or inactivate the bee venom proteins during the preparation and purification process.
B. Development of storage method for standard compound in bee venom
- To setup the method for validation of standard compound, SDS-PAGE, RP-HPLC, and SEC-HPLC (Size Exclusion chromatography HPLC) were carried out. The inhibition method for protein degradation using nano-structural molecules have been devised, which worked at model system composed of trypsin and bovine serum albumin. However, it did not successfully inhibit the proteolysis of bee venom protein.
- The incubation of naive bee venom in neutral pH leaded to change slightly the protein profile on SDS-PAGE, which might be caused by some proteases. We have proposed the improved methods for preparation and purification process of bee venom, carried out at slightly acidic pH to block protease activity.
C. Stability test
- The stability tests for 4 different formulations of bee venom product have been performed on the basis of ‘Guideline for stability test of veterinary pharmaceuticals (Animal and Plant Quarantine Agency, Notification No. 2008-15)’ to supply the scientific data for establishment of the term of validity.
- RP-HPLC has been run to analyze the melittin contents of sample for long-term test, accelerated test and stress test. The data showed formulation #2 maintained prolonged stability, but formulation #1 elicited poorer stability.
D. Protein analysis supporting for co-workers
- We have also supported our co-workers of Wissen Co. and Chungnam Univ. to analyze physico-chemical properties of bee venom protein and consulted about method of protein analysis and validation during research period.
4. Development of spray formulation of bee venom and sustained formulation of bee venom through microencapsulation
- Stability study of bee venom according to the fabrication environment of bee venom formulation: To figure out the stability of bee venom according to the fabrication condition of bee venom formulation, the effect of organic solvent, sonication and pH was examined. Also, the effects of heat and light were observed.
- Studies on the spray formulation of bee venom: Four kinds of formulation was prepared according to the pharamceutical excipients. Formular 1 showed the sustained release profile of melittin.
- Stability test of spray formulation of bee venom: Stability test was processed for 8 weeks. The melittin amount was maintained. pH of the solvent of bee venom was maintained below 6.0. The limit test of lead, arsen was satisfied under 5 ppm. The heavy metal test was satisfied. Also, The limit of bacterial test was satisfied.
- Studies on preparation and evaluation of the bee venom-loaded sustained particles: The size of PLGA particles employing sonication method was about 500 nm. But the size of PLGA particles employing homogenization method was about 2 um. Zeta-potentials of PLGA particles were negative value. FT-IR results detected that bee venom was completely encapsulated in PLGA by disappearing amine and amide peaks. In addition, bee venom in PLGA particles was not disintegrated and intact by SDS-PAGE analysis. The release of bee venom showed a sustained profile during 1 month through in vitro release study. These bee venom-loaded PLGA particles could resolve patient inconvenience with the remarkable advantage of reduced number of injections.
5. Process of Korean Bee Venom for Mass production and Quality Control for the Standardization of manufactures
- Wissen newly manufactured all-in-one device for collecting bee venom (BV), and separation, identification, and characterization of the active ingredients from the fresh natural bee venom were carried out by way of producing bee venom in bulk.
- In contrast to the existing products containing BV ingredients which have been commercialized on the basis of mellitin content as a sole index compound, the specialized form of BV containing water & lipid-soluble ingredients has been manufactured, and the BV fraction reinforcing immune function has been selected and its quantitative analytical methods have also been manifested and established.
- Particularly, the lipid-soluble ingredients such as 11(Z)-eicosen-1-ol, Chrysin, and Pinocembrin were isolated from the non-protein BV fraction which has never been studied, and their chemical structures were identified. Also, the standard analytical methods for determining biological activities of BV by assaying the enzyme activities such as HAase (hyaluronidase), PLA2 (Phospholiphase A2) etc. were established.
- The powder-prototype with enhancing immune activities has been manufactured and its clinical protocol is going to be submitted to NVRQS (National Veterinary Research and Quarantine Service). For commercialization, it was registered as the trade mark "Api Chicks“, immuno-potentiator for poultry.
- Besides this, the trade marks, ‘Api Dons’ for pigs, ‘Api Woos’ for oxen, were applied for registration. In addition, the trade mark registration of PLGA-coating immuno-potentiator for oxen and pigs requires more other tests which are expected to cost-consuming procedure, thus we are considering about the possibilities for separate research activities.
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 10
- CONTENTS ... 18
- 목 차 ... 21
- 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 23
- 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 23
- 1. 가축질병에 의한 경제적 손실의 증가 ... 23
- 2. 집단사육으로 인한 전염성 질병에 대응할 항병력 감소 ... 23
- 3. 항생제 사용 억제로 인한 항생제 대체제 개발과 기술의 보급이 시급함 ... 23
- 4. 가축질병에 대한 봉독제품의 개발 필요성 ... 23
- 제 2 절 연구개발의 최종 목표 ... 24
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 25
- 1. 국내 기술개발 현황 ... 25
- 2. 국외 기술개발 현황 ... 25
- 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 26
- 제 1 절 봉독을 이용한 가축치료제의 면역활성 효능 검증 ... 26
- 1. 연구목표 ... 26
- 2. 정제봉독의 안정화된 제형의 효능비교 ... 26
- 3. 닭에서 정제 봉독의 면역 및 사양 효과규명 ... 41
- 4. 돼지에서 봉독치료제의 면역효과 규명 ... 62
- 5. 정제봉독의 투여에 따른 송아지에서의 면역증강효과 ... 70
- 6. 서방형 봉독 제제의 투여에 따른 돼지에서의 면역 효능 평가 ... 74
- 제 2 절 봉독을 이용한 가축치료제의 닭, 돼지, 소에서의 세균성 및 바이러스성 질병에 대한 항병력 효과 연구 ... 81
- 1. 연구목표 ... 81
- 2. 봉독의 육계에서 면역효능평가 및 수지봉독 분무에 의한 육계에서의 살모넬라 감염증 예방효과 ... 81
- 3. 돼지에서 최종 선별된 수지봉독의 투여에 따른 살모넬라 감염증 예방효과 ... 103
- 4. PCV2와 PRRSV에 동시에 인공 감염된 이유자돈에서 정제 수지봉독의 예방효과 ... 115
- 5. Bovine rota virus, Bovine corona virus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium 혼합 인공감염된 송아지에서 정제 수지봉독의 예방효과 ... 129
- 6. 서방형 봉독제제의 Salmonella Typhimurium에 인공 감염된 이유자돈에서 예방효과 ... 140
- 제 3 절 생봉독 성분의 안정화 및 유효성분들의 규격화 ... 150
- 1. 봉독유효성분의 물리화학적 성질 규명 ... 150
- 2. 지표성분의 보존 방법 개발 ... 162
- 3. 안정성 시험 ... 166
- 4. 공동연구자들에 대한 분석업무 지원 ... 174
- 5. 결론 및 고찰 ... 178
- 제 4 절 봉독의 spray 제제개발과 마이크로캡슐화를 통한 서방형 제제개발 ... 180
- 1. 봉독 물리 화학적 특성 측정 ... 180
- 2. 봉독 spray 제형 ... 189
- 3. 봉독 봉입된 서방형 입자 ... 213
- 제 5 절 한국산 봉독의 대량 채취 및 동물의약품 등록을 위한 제품 개발 ... 232
- 1. 봉독의 대량생산 ... 232
- 2. 봉독의 분리, 정제 및 전처리 ... 238
- 3. 봉독(bee venom) 의 기시법 확립 ... 244
- 4. 봉독제형 개발 ... 258
- 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 263
- 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 264
- 제 1절 제품등록 ... 264
- 제 2 절 사업화계획 ... 264
- 1. 봉독원료 확보 ... 264
- 2. 봉독수매 절차 ... 266
- 3. 제품 판매 전략 ... 268
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 271
- 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 272
- 제 8 장 참고문헌 ... 273
- 연구개발보고서 초록 ... 274
- 끝페이지 ... 280
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