[보고서]SirT1에 의한 HIF-1과 HIF-2의 선택 조절을 이용한 암치료 표적 발굴

박종완

SirT1에 의한 HIF-1과 HIF-2의 선택 조절을 이용한 암치료 표적 발굴
Discovery of anticancer targets using SirT1's selective regulation of HIF-1 and HIF-2 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	서울대학교 산학협력단
연구책임자	박종완
보고서유형	1단계보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-10
과제시작연도	2012
주관부처	미래창조과학부 KA
사업 관리 기관	한국연구재단
등록번호	TRKO201400006438
과제고유번호	1345168712
DB 구축일자	2014-05-31
키워드	저산소유도인자,암,혈관신생,아세틸화,대사조절Hypoxia-inducible factor,SirT1,Cancer,Neovascularization,Acetylation,Metabolism

초록 ▼

- SirT1의 저산소 상황에서의 HIF-1α와 HIF-2α의 선택적 조절 기전을 밝힘
- Cervical cancer cell에서 SirT1의 암세포 생존에 대한 역할 규명
- 종양미세환경에서의 SirT1의 역할 규명
- 저산소에서 SirT1에 의한 암세포의 autophagy와 EMT 조절 기전 규명
- 폐암에서 SirT1과 저산소에 의한 항암제 내성 기전 및 내성 극복의 전략 구축
- 저산소 조건에서의 선택적 HIF 조절 약물 스크리닝 시행
- Hypoxia-HIF-EMT axis”에 의한 pol

Abstract ▼

Purpose:
To investigate whether selective inhibition of HIF by manipulating of SirT1 or its upstreams can provide a novel treatment modality for HIF-1 or HIF-2 dependent cancers, and to estimate the potentialities of SirT1 regulators as a drug target for effetice anti-cancer therapy.
Contents:
□ To examine selective regulation of HIF by SirT1 in various cancer cell lines
◦To use HIF-1-dependent cancer cells and HIF-2-dependent cancer cells
◦To evaluate the effect of overexpression or inhibition of SirT1 on HIF activation as well as survival and proliferation of cancer cells.
◦To select cancer cell lines for vivo cancer model based on the results above.
□ To estimate the possibility of selective anti-cancer therapy by controlling SirT1
◦To establish SirT1 stable cell line from HIF-1/2-dependent cancer cells and evaluate tumor growth and angiogenesis in xenografts
◦To investigate the promoting or inhibiting effect of SirT1 activator and inhibitor on tumor growth.
□ To build the assay system for targetting HIF-selective regulators and to screen
◦To produce specific antibodies for acetyl-K674-HIF-1a and acetyl-K685-HIF-2a and to evaluate the activation of SirT1 and upstream regulators using immunoblotting
◦To devise a new reporter system (Gal4-fusion) to distinguish HIF-1a from HIF-2a
◦To select the molecules, which regulate HIF specifically, in a population of both SirT1 expression/activation regulators
◦To sort the molecules, which regulate HIF specifically, in metabolites and enzymes involved in the metabolic pathway of SirT1 modulation
□ To confirm the anti-tumor effect of selected target molecules for specific regulation of HIF.
◦To establish target-expressed or -knock-out stable cell line from HIF-1/2-dependent cancer cells
◦To evaluated selective anti-cancer effects of target molecules using established cell lines in xenografts model
◦To assess the target efficiency by measuring acetyl-HIF-1a/HIF-2a in tumor
□ To screen drugs which regulate HIF selectively
◦To search chemical library using assay system established above
◦To evaluated anti-cancer effect of selected drugs in Xenograft tumor model
Expected contribution:
□ Treatment of cancer
◦A novel anti-cancer treatment modality to modulated HIF-1 and HIF-2 specifically
◦Brand-new strategy for selective anti-cancer therapy based on the HIF-1/2-dependency of cancer cells
◦Understanding the interactive network between metabolic regulators and hypoxic-adaptation molecules
□ Treatment of other hypoxia-related diseases
Distinct function of HIF-1 and HIF-2 reported in anemia, cardiovascular diseases, diabetic retinopathy, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatic arthritis, etc. Accordingly, current study can provide the target molecules leading selective treatments for these HIF-related diseases

목차 Contents

표 지 ... 1
제 출 문 ... 3
요 약 문 ... 5
SUMMARY ... 7
CONTENTS ... 8
목 차 ... 8
제1장 연구개발과제의 개요 ... 9
1. 암과 저산소 ... 9
2. Hypoxia-inducible factor (HIF) ... 10
3. HIF-1α와 HIF-2α는 성격이 다른 형제 ... 12
4. 질병에서 HIF-1α와 HIF-2α의 다른 역할 ... 13
5. HIF-1α와 HIF-2α를 선택적으로 통제할 방법은? ... 15
6. Sirtuin에 대한 기본 정보 ... 15
제2장 국내외 기술개발 현황 ... 18
1. 국내 ... 18
2. 국외 연구현황 ... 20
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
I. SirT1의 HIF-1α와 HIF-2α 선택적 조절 기전 ... 20
II. Cervical cancer 진행에서 SirT1의 역할 ... 25
III. 종양미세환경에서의 SirT1의 역할 ... 31
IV. 저산소-SirT1에 의한 암세포의 autophagy와 EMT 조절 ... 34
V. 폐암에서 SirT1에 의한 저산소성 항암제 내성 기전 ... 37
VI. 저산소 조건에서의 선택적 HIF 조절 약물 스크리닝 ... 50
VII. Hypoxia-HIF-EMT axis”에 의한 polyp형성 기전 발견 ... 55
VIII. 저산소 환경에서 증가하는 Mad1에 의한 항암제 내성의 유도 ... 58
IX. Wnt 신호전달의 negative feedback을 통한 ITF2의 종양 억제 ... 65
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 73
(1) 연구개발의 최종목표 ... 73
(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 73
(3) 계획대비 달성도 ... 74
(4) 위 연구목표에서 중요도 순으로 목표 추출 및 가중치 부여 ... 75
제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 75
가. 활용계획 ... 75
나. 활용방법 ... 77
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 78
1. 저산소 상황에서 SirT1의 HIF 의존적인 발현양 증가 ... 78
2. SirT1의 억제로 인한 저산소 조건에서의 HIF-1a의 축적과 전사활성 조절 ... 78
3. 저산소시 choroidal endothelial 세포에서 HIF-2a에 의한 SirT1 의존적인 VEGF 증가 ... 79
4. 스트레스 반응 탈아세틸화 효소인 sirtuin 1에 의한 HIF-2a 신호전달의 조절 ... 79
제7장 연구시설ㆍ장비 현황 ... 82
제8장 참고문헌 ... 82
끝페이지 ... 92

표/그림 (77)

표 그림 1 Structures of HIF-1α and HIF-2α
표 그림 3 Differential roles of HIF-1α and HIF-2α in protein interactions
표 그림 2 Differential roles of HIF-1α and HIF-2α
표 그림 4 Roles of HIF-1α and HIF-2α along decreasing oxygen
표 그림 5 대사성 SirT1 조절
표 그림 6 SirT1 regulation through protein interaction.
표 Fig. I-1. SirT1이 표적으로 하는 HIF-1α와 HIF-2α의 lysin 잔기의 아세틸화 항체 제작 및 효과 측정.
표 Fig. I-2. SirT1은 HIF-1α의 전사활성은 억제하고 HIF-2α의 전사활성은 촉진함
표 Fig. I-9. SirT1은 HIF-1α의 전사활성을 억제하고 HIF-2α에 대한 조절기전은 세포의 존적으로 나타남
표 Fig. I-10 SirT1은 HIF-1α와 HIF-2α의 전사활성을 조절하여 HepG2 세포의 세포성장을 촉진시킴
표 Fig. I-11. SirT1은 HIF-1α와 HIF-2α의 하위 유전자들을 서로 다르게 조절함.
표 Fig. II-1 5가지 cervical cancer cell line에서 SirT1을 knock-down 72시간 후에 cell death 관찰
표 Fig. II-2 SirT1이 SiHa cell의 cell cycle과 proliferation에 미치는 영향
표 Fig. II-3 SiHa에서 SirT1 knock-down한 뒤 얻은 conditioned media를 다시 SiHa에게 treat하고 time dependent cell death를 확인.
표 Fig. II-5 (A, B) SiHa와 HeLa에서 SirT1 knock-down시 분비되는 factor를 찾기 위한 proteom profiler assay. (C) SiHa에서 SirT1 knock-down후 Microarray.
표 Fig. II-4 origin이 다른 cervical cancer cell과 normal cell에서 SirT1 knock-down하여 얻은 conditioned media에 의한 cell death관찰
표 Fig. II-6 (A) SiHa에 Sirtinol 100 μM을 처치 후 proteome profiler assay 실시. (B) SiHa에 Sirtinol 100 μM을 처치 후 cell cycle 확인.
표 Fig. II-7 (A) cervical cancer cell에서 SirT1 knock down시 분비되는 IP-10을 Western blotting으로 확인. (B) cell line 별로 IP-10의 receptor인 CXCR3를 확인. (C, D) HeLa와 SiHa에서 SirT1 knock-down시 JAK-STAT pathway의 변화를 확인
표 Fig. II-8 SiHa에서 SirT1 knock-down에 의한 cell death의 기전을 밝히기 위한 western blotting 결과.
표 Fig. III-1 SirT1 TG mouse 확인
표 Fig. III-3 The role of SirT1 in tumor and tumor microenvironment.
표 Fig. III-4 The role of SirT1 in tumor angiogenesis
표 Fig. IV-1 (A) HCT116 세포주에 농도별로 Rapamycin을 24시간동안 처리하여 적정 농도를 결정함. (B) 20 mM Rapamycin을 24 시간 동안 다섯 종류의 인간 암세포주 (HCT116, HT29, AGS, MCF7, A549) 에 처리하였을 때 SirT1의 발현을 비교. (C) Rapamycin 24 시간 처리 시 apoptosis 관련 단백질의 변화 비교.
표 Fig. IV-2 (A) 대장암세포주 24 시간동안 저산소 상황에 나둔 후 LC3Ⅱ 발현 비교. (B) 4종의 암세포주를 저산소에 24시간 나둔 후 SirT1의 발현양 확인.
표 Fig. IV-4 HCT116과 AGS 세포에 SirT1 inhibitor인 sirtinol 처리 후 LC3 변화 관찰.
표 Fig. IV-3 (A) SirT1 knock-down 후 저산소에서 유도되어진 LC3II 관찰. (B) SirT1 과발현 후 저산소에서 유도되어진 LC3II 관찰.
표 Fig. IV-5 폐암, 위암, 대장암 세포주에서 SirT1을 knock-down했을 때 일어나는 EMT marker의 변화를 확인한 Western blotting.
표 Fig. V-1 Cell viabilities of cisplatin and doxorubicin in various cancer cells under normoxic and hypoxic condition.
표 Fig. V-2 The check of SirT1 protein and mRNA level in normoxia and hypoxia condition.
표 Fig. V-3 Hypoxia-induced resistance to cisplatin and doxorubicin are due to SirT1 down-regulation in NSCLC cells.
표 Fig. V-4 AMPKalpha is inactivation in NSCLC cells during hypoxia leading to tumor resistance to cisplatin and doxorubicin.
표 Fig. V-5 The SirT1-AMPKalpha pathway underlies hypoxia-induced chemoresistance in NSCLC cells.
표 Fig. V-6 The SirT1-AMPKalpha pathway mediates caspase 9(+) cells in NSCLC cells.
표 Fig. V-6 The SirT1-AMPKalpha pathway mediates cleaved caspase 3 and PARP levels in NSCLC cells.
표 Fig. V-7 The hypoxic inhibition of SirT1-AMPKalpha pathway decrease cytochrome-c release from mitochondria in NSCLC cells.
표 Fig. V-9 The hypoxic inhibition of SirT1-AMPKalpha pathway decrease the ATP levels of mitochondria in NSCLC cells.
표 Fig. V-8 The hypoxic inhibition of SirT1-AMPKalpha pathway decrease the area, number, and perimeter of mitochondria in NSCLC cells
표 Fig. V-10 The hypoxic inhibition of SirT1-AMPKalpha pathway decrease the pro-apoptotic makers of mitochondria in NSCLC cells.
표 Fig. V-11 The anticancer effect of cisplatin is augmented in H1299 tumors by activation of the SirT1-AMPK pathway.
표 Fig. V-12 The combination treatment cisplatin and SRT1720 more increases cleaved caspase 9, 3 and TUNEL(+) cells than these of each single or non-treatment.
표 Fig. V-13 A proposed mechanism underlying hypoxia-induced resistance to cisplatin and doxorubicin in NSCLC cells.
표 Fig. VI-1 Reporter assay, RT-PCR, Western blotting을 통한 약물선정.
표 Fig. VI-2 MTT assay를 통한 세포독성 테스트
표 Fig. VI-3 2047, 3380 약물에 의한 HIF의 activity 측정.
표 Fig. VI-5-4 그룹4 스크리닝 결과.
표 Fig. VI-5-3 그룹3 스크리닝 결과.
표 Fig. VI-5-2 그룹2 스크리닝 결과.
표 Fig. VI-5-1 그룹1 스크리닝 결과
$Fig. VI-4 132816 1차 스크리닝 fraction 명칭.$ 표 Fig. VI-4 132816 1차 스크리닝 fraction 명칭.
표 Fig. VI-7 26번 약물군 스크리닝 결과.
$Fig. VI-6 132816 2차 스크리닝 fraction 명칭.$ 표 Fig. VI-6 132816 2차 스크리닝 fraction 명칭.
표 Fig. VI-8 27번 약물군 스크리닝 결과.
표 Fig. VI-9 약물 26-7의 HIF 억제 효과.
표 Fig. VI-11 약물 26-7의 혈관형성 억제 효과.
표 Fig. VI-10 약물 26-7의 HIF down stream genes 억제 효과
표 Fig. VII-1. polyp 조직에서의 EMT. 정상조직(CM)과 단순 부비동염 조직(NM)에 비하여 polyp 조직(NP)에서는 상피세포 마커인 E-cadherin이 감소하고 간엽세포 마커인 a-SMA가 증가되는 현상이 관찰되었음
표 Fig. VII-2. HIF-1α에 의한 E-cadrine의 감소와 pSmad3에 의한 alpha-SMA의 증가. 저산소 환경에서 증가하는 HIF-1α를 knock-down시 E-cadrine의 감소가 회복되었고, 정상 산소 조건에서도 HIF-1α를 발현시키면 E-cad이 감소됨.
표 Fig. VII-3. polyp 조직에서의 HIF-1αlpha 발현. 면역 조직화학 염색시 HIF-1αlpha는 polyp조직 에서 뚜렷하게 발현되었으며, 과다증식 부분에서 발현이 더욱 현저함. 특히 HIF-1αlpha의 발현과 상피-간엽전환은 좋은 상관성을 보임.
표 Fig. VII-4. Mouse를 이용한 polyp 동물 모델에서 HIF-1 억제제에 의한 polyp 형성 억제 효과. HIF-1 억제제인 17-AAG과 2ME2를 비강내 투여하였을 때 polyp 발생이 현저히 감소함.
표 Fig. VIII-2. Mad1 is induced HIF-1-dependently under hypoxia
표 Fig. VIII-1. Hypoxic induction of Mad1 in colon and stomach cancer cells
표 Fig. VIII-4. Mad1 is involved in the hypoxia-induced resistance to doxorubicin
표 Fig. VIII-3. HIF-1α directly activates the transcription of the MAD1 gene
표 Fig. VIII-4. Mad1 is involved in the hypoxia-induced resistance to doxorubicin
표 Fig. VIII-6. Mad1 contributes to the formation of enlarged mitochondria under hypoxia. HCT116 cells were transfected with 40 nM of control or Mad1 siRNAs, and incubated under normoxia or hypoxia for 48 hours. Electron micrographs (x 25,000) of HCT116 cells from each condition were acquired. DOX, doxorubicin
표 Fig. VIII-5. Mad1 promotes hypoxiainduced mitochondrial inhibition by antagonizing c-Myc
표 Fig. VIII-7. Influence of Mad1 knock-down on cell cycle. HCT116 cells, which had been transfected with indicated siRNAs, were incubated in normoxia or hypoxia for 24 hours. The levels of indicated proteins were analyzed by Western blotting (upper panel), and cell cycle was analyzed by flow cytometry after propidium iodide staining.
표 Fig. VIII-8. Mad1 is involved in the hypoxic suppression of mitochondrial ROS production
표 Fig. VIII-9. Proposed mechanism of hypoxia- induced resistance to doxorubicin
표 Figure IX-1. Enhanced b-CTN/TCF4 transcriptional activation and reciprocally down-regulated ITF-2 expression in colon carcinoma
표 Figure IX-2. Loss of ITF-2 enhances b-CTN/TCF4 transcriptional activity
표 Figure IX-3. ITF-2 binds b-CTN and down-regulates its transcriptional activity via inhibition of b-CTN/TCF4 complex formation
표 Figure IX-4. ITF2 inhibits cell growth in colon cancer cells
표 Figure IX-5. ITF2 inhibits tumorigenesis in vivo
표 Figure IX-6. ITF2 suppression associates with poor survival in human colon cancer patients
표 Figure IX-8. Model for ITF2 regulation of b-catenin/TCF4 activity. In adenoma where the b-catenin degradation is deteriorated by APC deletion or b-catenin mutation, the negative feedback by ITF2 can play a suppressive role in terms of adenoma-to-carcinoma transition. Thus, the deletion of ITF2 leads to the uncontrollable activation of the Wnt/b-catenin signaling in tumor and the excessive expressions of c-Myc and cylin D1, which contributes to the highly malignant phenotypes.
표 Figure IX-7. ITF2 suppresses the TCF/LEF1-induced gene profiles in human colon tissues

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