초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
<제1세부과제 : 혈전용해 단백질 t-PA 생산 식물소재 기술 개발 및 생화학적 특성 분석연구>
○ 벼 형질전환체 게놈 내에 t-PA 유전자 삽입 수 결정
○ 벼 형 질전환체 내 t-PA 유전자 삽입 확인
○ ELISA 를 이용한 t-PA 함량 측정
○ t-PA 발현 벼 세대 진전
○ t-PA 발현 글루테린 억제벼 t-PA(T2, T3)벼 섬유소 활성 분석
○ t-PA 억제제(PAI-1) 이용 섬유소 활성 억제 분석
○ t-PA 부분정제조건조사(벼)
○ 피브린 용해

Ⅳ. 연구개발결과
<제1세부과제 : 혈전용해 단백질 t-PA 생산 식물소재 기술 개발 및 생화학적 특성 분석연구>
○ 벼 형질전환체 게놈 내에 t-PA 유전자 삽입 수 결정
○ 벼 형 질전환체 내 t-PA 유전자 삽입 확인
○ ELISA 를 이용한 t-PA 함량 측정
○ t-PA 발현 벼 세대 진전
○ t-PA 발현 글루테린 억제벼 t-PA(T2, T3)벼 섬유소 활성 분석
○ t-PA 억제제(PAI-1) 이용 섬유소 활성 억제 분석
○ t-PA 부분정제조건조사(벼)
○ 피브린 용해 활성 분석 및 Western blot 분석
○ t-PA 부분정제조건조사(모상근)
○ 재조합 단백질 정제용 t-PA 벼 포장증식
○ t-PA 벼와 당쇄조절 유전자 교배
○ 모상근 및 벼종자로부터 t-PA 정제 조건조사
○ 모상근 정제 t-PA 생화학적 특성 분석 (억제제 특성, 섬유소 분해 활성 특성 분석 등)
○ 당쇄 조절 유전자 knockout line 특성 분석연구
○ 벼 형질전환체 후대 전개에 의한 삽입 유전자 고정 계통 선발 (t-PA 발현 벼, 저장 단백질 억제 벼)
○ 벼 저장 단백질 억제에 의한 human t-PA 단백질 발현 증진 분석
○ T-DNA 삽입 변이체와 t-PA 발현 형질전환체 교배 및 세대진전
○ 인 체 t-PA 발현 벼 유전자 copy 수 확인(T4)
○ 인 체 t-PA 발현 벼 형질전환체의 생화학적 특성 분석 (T4)
○ F PL C를 이 용 한 t-PA 정 제
○ 포 장 증 식 벼 간 장 & 수 장 측 정
○ human t-PA 발현 고정 벼 형질전환체의 대량 증식
○ humanized t-PA 생산 벼 후대 전개에 의한 삽입 유전자 고정 계통 분석
○ Human t-PA 발현 고정 벼로부터 t-PA 부분정제
○ 당쇄 돌연변이 벼 증식 및 교배
○ 크로마토그래피를 통해 부분 정제된 단백질 분획 내 t-PA 단백질 동정
○ 항체-친화 크로마토그래피를 통한 t-PA 정제
○ Lysine-sepharose 크로마토그래피를 통한 t-PA 정제
○ 당쇄 돌연변이 벼 증식
○ Complementation 실험을 위한 벡터제작 및 벼 형질전환
< 제2세부과제 : Humanized 혈전용해단백질 t-PA의 당쇄구조 분석연구>
○ 식물체 특이 당쇄조절 유전자 확보
○ 벼 형질전환을 위한 식물체 특이 당쇄조절 유전자 RNAi 벡터 제작
○ 벼 현탁배양 세포주 형질전환을 위한 식물체 특이 당쇄조절 유전자 RNAi 벡터 제작
○ 인체 유래 당쇄조절 유전자 확보
○ 인체 유래 당쇄조절 유전자 발현 벡터 제작
○ α1,3-fucosyltransferase 및 β1,2-xylosyltransferase knock down 변이체 분석
○ RT-PCR을 이용한 벼 α1,3-fucosyltransferase 및 β1,2-xylosyltransferase knock down 변이체 선발
○ PCR을 이용한 당쇄조절 유전자 knock out 변이체 호모라인 선발
○ RT-PCR을 이용한 당쇄조절 유전자 knock out 변이체 분석
○ α1,4-fucosyltransferase 및 β1,3-galactosyltransferase knock out 변이체 호모라인 세대진전
○ 당쇄구조 분석 기반기술 확보 및 실험방법 확립
○ 식물유래 당단백질로부터 N-당사슬의 분리·정제
○ MALDI-TOF MS를 이용한 당단백질의 당쇄구조 분석
○ 인체 유래 당쇄조절 유전자 발현 벡터 제작
○ 식물 당단백질로부터 N-glycan들의 분리를 위한 PNGase A 농도 최적화
○ MALDI-TOF MS를 이용한 당단백질의 당쇄구조 분석
○ 식물 당단백질로부터 N-glycan들의 정제를 위한 크로마토그래피법 최적화
○ 벼 잎, 종자의 N-glycan 정제 및 분석
○ 당쇄조절 유전자 발현제어 RNAi 변이체 당단백질 당쇄구조 분석
○ 당쇄조절 유전자 발현제어 T-DNA 삽입 변이체 당단백질 당쇄구조 분석
○ 당쇄조절 유전자 RNAi 억제/도입 벼세포 변이체들의 당단백질 당쇄구조 분석
○ PCR을 통한 형질전환체 선발 (pANDA-Ubq-RI 벡터)
○ PCR을 통한 형질전환체 선발 (종자특이 발현제어용 pMJ21-GluB1-RI 벡터)
< 제3세부과제 : 식물체내 humanized t-PA 합성 및 제어 연구를 위한 식물소재 개발>
○ 벼 당쇄 유전자 조절을 위한 형질전환 체계 확립
○ 벼 현탁배양 세포(Oc cell) 유지 증식 보존
○ Agrobacterium을 이용한 현탁배양 Oc세포 형질전환
○ 화영벼 현탁배양 최적 배지조건 및 형질전환 세포주 확립
○ Agrobacterium을 이용한 형질전환 세포주 확립 (화영벼)
○ RNAi 이용 당쇄조절 유전자 형질전환 벼 및 형질전환 세포주 개발
○ 벼유래 당쇄조절 유전자 억제 변이체 형질전화체 확보
○ 제초제 저항성 유무 검정
○ 벼세포 형질전환체 확인
○ 항생제 농도 조사
○ 벼세포 형질전환체 증식
○ 당쇄조절 유전자 T-DNA 삽입 변이체 교배체 증식 및 분석
○ 당쇄조절 유전자 RNAi 억제/도입 벼 형질전환
○ GST-BphN fusion protein 생산을 위한 expression vector를 제작
○ BphP Antibody binding site 분석
○ Bacteriophytochrome과 기질 아미노산 fusion construction 제작
○ BphN-substrate amino acid- FBPase construction 제작, 발현 및 분리
○ Deinococcus radiodurans Bacteriophytochrome 특이 항체 제작 및 epitope mapping
○ 재조합 벼 모상근에서의 t-PA 추출 적정 buffer 조건 및 pH 확인
○ BphN-substrate amino acid- FBPase construction 제작, 발현 및 분리
< 제2협동과제 : 혈전용해 단백질 t-PA의 기내 대량생산 시스템 기술개발 연구>
○ 식물조직배양용 배지 대상 모상근 대량생산 최적배지 선발
○ 1차 선발된 배지(MS, B5, WPM)에 대한 모상근 대량생산 최적배지 선발
○ MS배지에 형질전환 모상근 대량생에 적합한 pH 수준 설정
○ 모상근 대량생산에 적합한 최적 탄소원 선발
○ 최적 탄소원으로 선발된 sucrose 적정농도 규명
○ t-PA 분리 정제용 모상근 생산 분양
○ t-PA 발현 모상근 대량생산 무기염류 최적농도 규명
○ t-PA 발현 모상근 대량생산 식물생장조절물질 종류 및 최적농도 규명
○ 형질전환 벼 세포주 수집 및 계대배양
○ 형질전환 벼 세포주 대량증식 배양
○ t-PA정제 등 분석용 모상근 시료생산 분양
○ 형질전환 모상근 대량생산 식물생장조절제(IBA) 적정 농도선발
○ 1. 2차년도 확립한 최적조건 규명 시험 처리에 대한 t-PA 함량 분석
○ 형질전환된 벼세포 수집 및 대량배양 최적조건 확립

Abstract ▼

Human tissue-plasminogen activator (t-PA) is a thrombolytic protein that plays an active role in dissolving fibrin clots by fibrinolysis and in activating plasminogen to plasmin in blood vessels. The recombinant t-PA produced in plants is a recombinant soluble protein derived from human t-PA. In thi

Human tissue-plasminogen activator (t-PA) is a thrombolytic protein that plays an active role in dissolving fibrin clots by fibrinolysis and in activating plasminogen to plasmin in blood vessels. The recombinant t-PA produced in plants is a recombinant soluble protein derived from human t-PA. In this project, an enzymatically active human t-PA protein was expressed in rice seeds using Agrobacteria-mediated transformation. The human t-PA gene integration into the nuclear genome and specific transcripts of the t-PA gene in transgenic rice plants was confirmed by PCR, Southern blot, flanking DNA sequencing, and RT-PCR. The fibrinolysis of recombinant t-PA was confirmed by a fibrin plate assay and zymography. Immunoblot analysis of the transformed rice seeds revealed the band of approximately 55 kDa recombinant t-PA. ELISA experiments demonstrated that the highest level of recombinant t-PA expression was approximately 0.2% of the total soluble protein in rice seeds. These studies demonstrated that plants could be employed as bioreactor systems for the production of an enzymatically active t-PA that has properties similar to the recombinant t-PA produced by mammalian cells. In addition, we have developed alternative expression system that can potentially be adapted for large scale production of biologically active and a medically important human recombinant t-PA. This expression system will be beneficial for lower cost of recombinant t-PA production.
Partial purification of the recombinant t-PA was performed from transgenic rice seeds using convenient buffer extraction methods and chromatographic methods (DEAE-sepharose, Concanavalin A, Mono-Q and Sephacryl S-200 chromatographies). In order to purify t-PA through removing high amount of storage proteins including glutelin, globulin and prolamin in rice seeds, partially purified t-PA showed two-major bands corresponding to type I and II t-PA. Also, major fraction containing t-PA activity was separated by one-dimensional SDS-PAGE and each gel slice was subjected to in-gel tryptic digestion. The peptides derived from putative t-PA bands were analyzed by nano-LC-ESI-MS/MS and were identified as human t-PA by NCBI non-redundant protein database. Based on these results, our convenient and cost-effective optimized purification method could be utilized in the large-scale purification of enzymatically active t-PA.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• 제 1 장 서 론 ... 11
• 1. 연구개발의 필요성 ... 11
• 2. 연구개발의 목표 ... 13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• (1) 세계적 수준 ... 14
• (2) 국내수준 ... 15
• (3)국내외의 연구현황 ... 16
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
• <제1세부과제 : 혈전용해 단백질 t-PA 생산 식물소재 기술 개발 및 생화학적 특성 분석연구> ... 17
• <제2세부과제 : Humanized 혈전용해단백질 t-PA의 당쇄구조 분석연구> ... 46
• <제3세부과제 : 식물체내 humanized t-PA 합성 및 제어 연구를 위한 식물소재 개발> ... 64
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 103
• 1절 : 목표대비 달성도 ... 103
• 2절 : 정량적 성과 ... 107
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 121
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 122
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 124
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 125
• 제 9 장 참고문헌 ... 126
• 끝페이지 ... 129