보고서 정보
주관연구기관 |
동국대학교 DongGuk University |
연구책임자 |
김준기
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-08 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400017510 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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키워드 |
항암활성.시알산.한약.다당류.시디엔이.anticancer activity.sialic acid.oriental medicine plants.cDNA.
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초록
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1. 복합당질의 당쇄구조에서 시알산당의 함량이 증가된 고도의 시알산화가 많은 인체 암조직세포에서 발견되고 있으며 이러한 현상은 암의 진행과정과 밀접한 관련성을 나타내고 있는데 이것은 암화과정에 있어서 시알산전이효소의 활성증가 의존하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 암관련 시알산전이효소로서 잘 알려져 있는 2종류의 시알산전이효소 [Galβ1,3,GalNAc α2,3-sialyltransferase (ST3Gal I)과 Galβ1,4GlcNAc α2,6-sialyltransferase (ST6Gal I)]의 효소활성에 대한 한방약제의
1. 복합당질의 당쇄구조에서 시알산당의 함량이 증가된 고도의 시알산화가 많은 인체 암조직세포에서 발견되고 있으며 이러한 현상은 암의 진행과정과 밀접한 관련성을 나타내고 있는데 이것은 암화과정에 있어서 시알산전이효소의 활성증가 의존하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 암관련 시알산전이효소로서 잘 알려져 있는 2종류의 시알산전이효소 [Galβ1,3,GalNAc α2,3-sialyltransferase (ST3Gal I)과 Galβ1,4GlcNAc α2,6-sialyltransferase (ST6Gal I)]의 효소활성에 대한 한방약제의 저해효과를 조사하고자 시도되었다. 5종류의 한방약제 [Scutellaria baicalensis Georgi ((黃芩), Coptidis Rhizoma (黃遭), Glycyrrhiza uralensis Fisch(自草), Bupleuri Radix (自草)는 100μg의 농도에서 ST3Gal I과 ST6Gal I에 대해서 각각 42%와 57%의 높은 저해효과를 나타내었고, Scutellaria baicalensis Georgi (黃芩)는 ST3Gal I과 ST6Gal I에 대해서 각각 23%와 20%의 저해효과를 나타내었다. 또한 Bupleuri Radix (柴胡)는 ST6Gal I에 대해서만 40%의 높은 저해효과를 나타내었고, 나머지 2종류의 한방약제 [Coptidis Rhizoma ((黃述), Platycodi Radix (恄梗)]는 전혀 저해효과를 나타내지 않았다. 한편, 3종류의 한방약제에 의한 저해효과는 농도 의존적으로 증가하였다.
2-1. 황백(Phellodendron chinese SCHNEID)으로부터 항암활성이 강한 다당류의 정제하여 실험용 생쥐중량 100g에 대해 2, 5 및 10 mg의 투여량으로 melanoma B-16-derived metastatic tumor에 대한 항암전이 활성과 면역과민증에 대한 효과를 검정하였다. 정제분획중에서는 분획 F-7과 F-8이 가장 강한 암전이억제 활성을 (각각 100g 생쥐중량당 2mg씩 투여하여 96.4와 98.2%의 억제활성을 보임) 나타내었으며 5mg/100g투여로 억제율이 95.3, 97.5%을 보였다. 나아가서, 10 mg/100 g을 피하주사 (i.p)로 투여하면 97.3, 98.7%의 억제율을 보였으나, 경구투여로는 활성이 약하였는데 이러한 결과는 정제 다당류가 암세포에 직접 작용하기 보다는 면역계에 직접 작용한다는 것을 밝히는 것이다. 이를 뒷 받침하는 것으로 다당류 투여가 말초혈액중의 leukocyte수와 총 peritoneal활액 세포수를 증가시켰다. 비록 종양세포를 생쥐에 이식하자 항체생성과 T세포반응성을 각각 9.3에서 6.3으로 7.7에서 5.9로 크게 감소시켰으나, 다당류 투여로 종양생쥐의 T 세포의 반응성을 증가시켰다. 특히, 분획 F-2, F-5, F-7 및 F-8은 효과적이었다. 또 이러한 결과는 본 다당류의 i.p. 투여가 구강섭취보다는 암전이억제에 효과적임을 나타내는 것이다.
2-2. 제2-1 및 발표논문(Glycoconjugate Journal 16, 247-252, 1999)에서 황백(Phellodendri cortex)의 다당류가 2-10mg의 투여량에서 C57BL/6XC3H 마우스의 항체생성세포 B-lymphocyte-자극활성을 나타내었음을 알 수 있었다. 또한 계속적으로 한약에서 생리활성을 갖는 다당류를 조사한 결과, 황백(Phellodendron chinese SCHNEID)에서 2, 5, 10mg/100g에서 항암활성을 가진 다당류 분획이 분리되었다. F-7과 F-8이 가장 뛰어난 저해활성을 나타내었으며(2mg/100g에서 저해율이 96.4 및 98.2%), 5mg/100g의 투여량에서는 각각 저해율이 95.3 및 97.5%로 나타났다. 또한 10mg/100g을 복강주사한 실험군에서는 97.3 및 98.7%의 저해율을 보였다. 경구투여의 경우 현저한 저해활성은 나타나지 않았으며, 이것은 다당류가 직접적으로 면역계에 작용함을 보여준다. TS와 TK의 활성을 살펴보면 TS의 활성은 F-2와 F-7을 처리한 마우스에서 73.7%에서 79.5%로 대조군에 비하여 현저하게 억제되었으며
2-3. 한방의 생약제로 쓰고있는 황금(Scutellaria baicalensis Georgi.)에서 얻은 추출물에 대하여 유지에 대한 항산화성 및 발암물질로 알려진 nitrosamine의 전구체인 아질산염의 소거효과를 검토하였다. 즉 황금추출물을 linoleic acid에 소정량 첨가하고 50℃에서 일정기간 저장하여 linoleic acid의 산화 안정성을 비교 검토하였으며, 또한 유지 자동산화의 촉진인자인 금속이온(Fe3+)을 첨가하여 황금 추출물의 금속이온 봉쇄효과를 조사하였다. 그리고 2mM NaNO2에 황금 추출물을 첨가하고 37℃에 저장하여 아질산염 소거효과를 검토한 결과는 다음과 같다. 황금 추출물의 항산화 효과는 전 농도별에서 높은 항산화 효과를 나타내었다. 그리고 시간 경과에 따른 항산화 효과에 있어서도 정도의 차이는 있지만 전 농도에서 유도기의 연장효과가 상당히 우수한 것으로 나타났다. 황금 추출물의 금속이온 봉쇄효과에 있어서는 linoleic acid에 황금 추출물과 Fe3+을 첨가한구가 황금 추출물의 무첨가구보다 항산화 효과가 아주 우수한 것으로 나타나 금속이온 봉쇄력이 강한 것으로 나타났다. 황금 추출물의 아질산염 소거효과에 있어서는 pH 1.2 강산성 조건하에서는 반응시간이 경과함에 따라 크게 증가 하는 것으로 나타났다. 그러나 pH 4.2 및 6.0 조건에서는 농도 및 반응시간의 경과에 따른 소거효과는 정도의 차이는 있으나 떨어지는 것으로 나타났다.
2-4. 한방의 생약제로 쓰고있는 황련(Coptis chinensis Franch.)에서 얻은 추출물에 대하여 유지에 대한 항산화 활성 및 아질산염 소거효과를 검토한 결과 다음과 같았다. 황련 추출물의 농도에 따른 항산화 효과는 전 농도별에서 높은 항산화 효과를 나타내었다. 시간 경과에 따른 항산화 효과에 있어서도 정도의 차이는 있지만 각 농도(5mg 및 10mg)에서 유도기의 연장효과가 상당히 우수한 것으로 나타났다. 황련 추출물과 항산화제와의 비교에 있어서는 합성 항산화제인 BHT 및 ascorbic acid와 거의 같은 항산화력을 나타내었으며, 천연 항산화제인 α-tocopherol보다는 아주 우수한 것으로 나타났다. 황련 추출물의 금속이온 봉쇄효과에 있어서는 linoleic acid에 황련 추출물과 Fe3+ 및 Zn2+을 첨가한구가 황백 추출물의 무첨가구보다 항산화 효과가 아주 우수한 것으로 나타나 금속이온 봉쇄력이 강한 것으로 나타났다. 또한 아질산염 소거효과를 검토한 결과 pH 1.2 강산성 조건하에서는 농도의 증가와 더불어 반응 3시간 후에는 40-85%로 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 pH 4.2 및 6.0 조건에서는 농도 및 반응시간의 경과에 따른 소거효과는 정도의 차이는 있으나 아주 미약한 것으로 나타났다.
2-5. CMP-NeuAc:lactosylceramide α2,3-sialyltransferase (GM3 synthase)를 암호화하는 cDNA를 이미 clone된 mouse GM3 synthase (mST3Gal V)와 human sialyltransferases의 보존된 영역의 아미노산 서열정보를 이용하여 인간태아의 뇌세포 cDNA library에서 분리하였다. Human GM3 synthase의 cDNA 서열은 362개의 아미노산을 code하는 open reading frame을 포함하고 있으며, 이 효소의 1차구조를 통해 type II membrane protein topology와 sialylmotifs도 포함하는 다른 sialyltransferases에서 특징적인 구조적 형태들을 예상할 수 있었다. 이 cDNA을 mST3Gal V과 비교 분석한 결과 nucleotide와 아미노산 수준에서 각각 85%와 86%의 동일성을 보였다. 이 gene은 인간 태아와 성인 조직에서 모두 매우 제한적으로 발현한다.
Abstract
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1. In many cases of human cancer, the appearance of hypersialylated glycan structures is related to a precise stage of the disease; this may depend on the elevated sialyltransferase activity during carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the inhibitory effects of Chinese medicinal h
1. In many cases of human cancer, the appearance of hypersialylated glycan structures is related to a precise stage of the disease; this may depend on the elevated sialyltransferase activity during carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the inhibitory effects of Chinese medicinal herbs on enzymatic activities of two kinds of sialyltransferase, Gal (J 1,3GaINAc a 2,3-sialyltransferase (ST3GaJ 1) and Gal (J l,4G1cNAc a 2,6-sialyltransferase (ST6Gal 1), which are well known as glycosyltransferases associated with cancer. The aqueous extracts of Scutellaria baicalensis Georgi, Coptidis Rhizoma, Glycyrrhiza uralensis Fisch, Bupleuri Radix and Platycodi Radix were prepared and tested, respectively. At concentration of 100fLg, Glycyrrhiza uralensis Fisch showed the highest inhibitory effects (about 42 % and 57 %, respectively) on ST3Gai I and ST6Gal I activities. ST3Gal I was inhibited about 23 % by Scutellaria baicalensis Georgi, but not by the other samples, whereas ST6Gai I was inhibited about 20 % and 40 %, respectively, by Scutellaria baicalensis Georgi and Bupleuri Radix. All inhibitory effects were obtained in a concentration-dependent manner.
2-1. The polysaccharide fractions were isolated and purified from Phellodendron chinese SCHNEID, and antitumor activities using the melanoma B-16-derived metastatic tUmors were examined at dosages of 2, 5 and 10 mg/100 g. F-7 and F-8 showed the highest tumor metastatic inhibitory activities (inhibition ratio 60 and 80% in 2 mg/100 g), and in dose of 5 mg/lOO g, the inhibitory ratios were 85 and 70%, respectively. Furthermore, 10 mg/100 g of intraperitoneal (i.p.) injection gave 90 and 95% of inhibition.
When the effects of polysaccharides on hypersensitivity were examined, the inhibitory activities were not markedly observed in oral administration, indicating that the polysaccharides are directly acting to immune system. Also, the polysaccharides increased the number of circulating blood leukocytes and total peritoneal exudate cells. Although implantation of tumor cells greatly decreased the productivity of antibody (antibody-mediated) and T lymphocyte reactivity (delayed-type) as 6.3 from 9.3 and 5.9 from 7.7, represented by the increase of footpad thickness, respectively. the polysaccharides elevated the reactivity of T lymphocyte in tumor-bearing mice, which were rapidly recovered by discontinuance of sample treatments. Especially, F-2, F-5, F-7 and F-8 remarkably recovered the decreased sensitivity.
These results clearly indicated that the i.p. injection is much effective to suppress tumor growth than oral administration.
2-2. In a previous paper (Kim et aI., Glycoconjugate Journal 16, 247-252, 1999), heteropolysaccharides from Korean medicinal plant, Phellodendri cortex (Hwangbek) showed a poten B-lymphocyte-stimulating activity in a system using polyclonal antibody forming cells in C57BL/6XC3H mice at dosages of 2-10 mg. In a series of biolgical active polysaccharides from natural medicinal plants, the polysaccharide fractions were isolated and purified from Phellodendron chinese SCHNEID, and antitumor activities were examined at dosages of 2, 5 and 10 mg/lOO g. F-7 and F-8 showed the highest tumor inhibitory activities (inhibition ratio 96.4 and 98.2% in 2 mg/lOO g), and in dose of 5mg/100 g, the inhibitory ratios were 95.3 and 97.5%, respectively. Furthermore, 10 mg/100g of intraperitoneal (i.p.) injection gave 97.3 and 98.7% of inhibition. In oral administration, the inhibitory activities were not markedly observed, indicating that the polysaccharides are directly acting to immune system. When the effects on TS and TK activities were determined, TS activities in the F-2 and F-7-treated mice were markedly suppressed to 73.7% and 79.5% of that in the control (p<0.01), while there was little difference in TK activity with a slight decrease in F-2 only. However, in i.p. injection, TS .activities in the F-2, F-5, F-7 and F-8-treated mice were markedly suppressed to 83% to 85% of that in the control (p<0.01). Furthermore, there was also significant differences in TK activities in F-2, F-5, F-7 and F-8-treated mice (p<0.05).
Therefore, polysaccharide fraction F-8 was further purified to active fractions of F-9 and F-ll by gel permeation chromatography using TSK Gel HW50S. The purified polysaccharides of F-9 and F-11 were composed of GlcNAc (47.3%), Gal (24.7%) and Man (28.0%). These results clearly indicated that the i.p. injection is much effective to suppress tumor growth than oral administration.
2-3. Scutellaria baicalensis Georgi. is also investigated to examine the antioxidant activity and mtnte scavenging action of the water extract from Scutellaria baicalensis Georgi. The extract exhibited antioxidative effect at all concentrations tested. With metal ion(Fe:l+) present, the extract showed strong antioxidative effect. Nitrite scavenging effect was increased with increasing concentration of the extract.
The nitrite scavenging effect was the most remarkable at pH 1.2. However, nitrite scavenging effect of the extract decreased at pH 4.2 and 6.0
2-4. On the other hand, it was shown that the antioxidant actIvlty of the water extract from Coptis chinensis Franch(Hwangyon). Coptis chinensis Franch exhibited antioxidative activity at all concentration tested. The extract was as good as antioxidative activity of the synthetic antioxidants, butyJated hydroxy toluene and ascorbic acid. Furthermore, this was superior to that of natural antioxidant, a -tocopherol. In the presense of heavy metal ions (Fez+, Zn2+), Coptis chinensis Franch showed strong antioxidative activity. The extracts showed about 30-70% in the nitrite scavenging effect under pH 1.2 and 3TC for 1 hr. There was significant difference among concentration of extracts. In contrast, nitrite scavenging effect of the extracts decreased in high pH conditions. In addition, the effect was the most remarkable at pH 1.2 among various pH ranges examined, and it was increased depending on concentration of extracts in the course of reaction time of 30 min to 3 hr.
2-5. The cDNA encoding CMP-NeuAc:lactosylceramide a2,3-sialyltransferase (GM3 synthase) was isolated from human fetal brain cDNA library using sequence information obtained from amino acid sequences found in the conserved regions of the previously cloned mouse GM3 synthase (mST3Gal V) and human sialyltransferases. The cDNA sequence included an open reading frame coding for 362 amino acids, and the primary structure of this enzyme predicted all the structural features characteristic of other sialyltransferases including a type II membrane protein topology as well as both sialylmotifs.
Comparative analysis of this cDNA with mST3Gai V showed 85% and 86% identity in the nucleotide and amino acid levels, respectively. The expression of this gene is highly restricted in both human fetal and adult tissues.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 목차 ... 3
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
- Project Summery ... 6
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 13
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 24
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 26
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 29
- 6. 첨부서류 ... 30
- 세부연구개발과제 연구결과 ... 61
- 1. 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 62
- 2. 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 66
- 3. 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 67
- 4. 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 129
- 5. 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 131
- 6. 세부연구개발과제의 활용계획 ... 133
- 7. 참고문헌 ... 134
- 끝페이지 ... 134
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