초록 ▼

바이러스성 감염 질환은 숙주세포 내에서 증식하는 바이러스의 특성상 항체생산을 유도하는 기존의 백신제제룹 이용한 예방만이 최선이었으나 이미 감염된 환자의 경우 짐병올 완전히 치유하기 위하여, 체내의 면역반응을 통하여 감염세포플 직접 파괴하는 세포성 변역을 유발시켜야 한다. 세포매개성 변역반응이란 항원을 직접 인지하여 제거하는 항체에 의한 변역반응과 달리, 바이러스에 감염된 세포나 암세포와 같이 제거되어야 할 표적세포를 cytotoxic T lymphocytes (CTL)가 인식하여 살해함으로써 질병을 치료하는 체내의 변역반응윤 말한다

바이러스성 감염 질환은 숙주세포 내에서 증식하는 바이러스의 특성상 항체생산을 유도하는 기존의 백신제제룹 이용한 예방만이 최선이었으나 이미 감염된 환자의 경우 짐병올 완전히 치유하기 위하여, 체내의 면역반응을 통하여 감염세포플 직접 파괴하는 세포성 변역을 유발시켜야 한다. 세포매개성 변역반응이란 항원을 직접 인지하여 제거하는 항체에 의한 변역반응과 달리, 바이러스에 감염된 세포나 암세포와 같이 제거되어야 할 표적세포를 cytotoxic T lymphocytes (CTL)가 인식하여 살해함으로써 질병을 치료하는 체내의 변역반응윤 말한다. 본 연구에서는 사회, 경제적으로 큰 비중을 차지하고 있는 B 형 간염 바이러스에 기인한 간염을 이와 같은 세포매개성 면역반응을 유도함으로써 치료플 하고자 제제플 개발함을 목표로 하였다. 이를 위하여 HLA 분자와 결합한 항원제시과정을 이해하고 HLA -restricted peptide를 제제화하여 저하된 세포매개성 면역반응을 다시 항진시키고자 하였다.
본 연구의 결과로 B형 간염 바이러스에 특이적으로 작용하는 세포독성 T 세포를 유도하는 peptide를 결정하였다. 특히 B형 간염바이러스의 단백질 중 X 단백질에 대한 CTL epitope peptide에 대하여 specific cytotoxicity를 보이는CTL을 만성간염환자의 말초혈액에서부터 유도할 수 있는지 봄으로서 J 최종적으로 3가지 peptide를 결정하였다. 또한 peptide를 세포 내로 전달하여 CTL을 유도하는 시스템으로 liposomes을 사용하였는데, liposome의 조성 및 제조방법을 확립하였다. Liposome은 POPE를 사용하여 pH -sensitive liposome를 만들어, CTL을 유도할 수 있는 항원제시경로를 따르도록 하였다. Extruder를 이용하여 균질한 크기의 liposome 현탁액을 얻고 이를 동결건조하여 stability를 높였다. 이렇게 제제화된 B형 간염 바이러스의 면역치료제에 대한 안정성 및 안전성시험을 완료하였다.
최종적으로 완성된 제제를 본 연구팀이 만든 A2/Kb transgenic mice에 주사하여 in vivo에서 peptide specific CTL올 유도할 수 있는지, 그래서 virus 에 대한 방어효과를 나타내는지 animal model을 통하여 확인하였다. 그 결과 본 제제는 A2Kb mouse에서 2회의 면역으로 2-3주 후에 충분한 정도의 cellular immunity를 유도하는 것으로 확인되었다.
한편, 만성간염환자의 면역상태를 분석하여 T세포 및 자연살해세포가 정상인에 비하여 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다.
본 연구의 기초과정으로, 항원이 표적세포의 표면에 제시되는 과정을 연구하여
HLA-A2 분자를 발현하는 세포주를 만들었고 이는 임상시험 또는 기초시험에서 CTL의 효능을 확인하는 과정에서 사용될 수 있다.
본 과제의 완성을 위하여 가톨릭 의과대학 성모병원과 함께 임상시험을 실시하고자 준비중이다.

Abstract ▼

The enhancement of the cellular immunity is necessary to the clearance of the viral disease because the infected virus proliferate within the host cell The cellular immune response activate the cytotoxic T lymphocyte through MHC class I in antigen presenting cell as a complex with viral or tumor ant

The enhancement of the cellular immunity is necessary to the clearance of the viral disease because the infected virus proliferate within the host cell The cellular immune response activate the cytotoxic T lymphocyte through MHC class I in antigen presenting cell as a complex with viral or tumor antigen peptide, and the activated cytotoxic T cell can lysis the viral infected or tumor cell.
ln this study, we try to develope the immunotherapeutics that induce the cellular immune response against HBV related hepatitis. So, we want to understand the intemal antigen presentation pathway, formulate the HLA -restricted peptide drug, and elicit the cellular immunity in hepatitis patients. As a result, we confirmed the three epitope peptides that induce the HBx-specific CTLs by epitope screening program, computer modeling, peptide binding assay. These peptides induce the specific CTL from the peripheral blood of hepatitis patients in vitro.
The liposome systems are used to deliver the peptide into the cytosol like intemal antigenic peptides. We determined the composition and the protocols of liposome formulation, and test the stability, CTL induciblity, pH-sensitivity, Ca2+-sensitivity. The peptide-encapsulated pH-sensitive liposome are reviled that it was very stable in freeze-dried form for two years long. We formulate the therapeutics by filtration methods using extruder, and finished the pre-clinical test in rat, beagle dog, and rabbit. We found that it was very safe reagent in these animal and any unrespected symptom.
We developed the A2Kb transgenic mouse as an animal model for HLA -restricted HBV therapeutics. A2Kb transgenic mice that immunized the peptides encapsulated in liposome, protect the viral challenge using recombinant vacclma virus-HBx. Finally, we confirm the efficacy of the immunotherapeutics using peptide-liposome in vitro and in vivo.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 16
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 18
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 21
• 6. 첨부서류 ... 21
• III. 제1세부 연구개발과제 연구결과 ... 22
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 23
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 26
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 40
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 73
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 79
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 81
• 7. 참고문헌 ... 82
• IV. 제2세부 연구개발과제 연구결과 ... 85
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 86
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 87
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 87
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 89
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 90
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 90
• 7. 참고문헌 ... 91
• V. 제 3 세부 연구개발과제 연구결과 ... 92
• 1. 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 93
• 2. 제 3 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 93
• 3. 제 3 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 95
• 4. 제 3 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 102
• 5. 제 3 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 104
• 6. 제 3 세부연구개발과제의 활용계획 ... 104
• 7. 참고문헌 ... 105
• 끝페이지 ... 106