초록 ▼

현재 임상적으로는 뇌하수체성 인간성장호르몬의 공급부족과 Creutfeldt-Jacob씨 병의 부작용으로 유전공학적 방법으로 생산된 인간성장호르몬이 단백질의 안정성을 고려하여 동결건조 시키거나, 특정 formula의 액상으로 개발되어 널리 사용되고 있다. 하지만 이들 제품은 목적한 치료효과를 얻기 위해서는 장기간 매일 투여해야 하므로 환자의 부담(고통)을 야기 시키는 문제점을 갖고 었다. 이에 생체 분해성 고분자 미렵구를 이용하는 depot 형태의 제어 방출성 삽입주사제를 개발이 요구된다. 이러한 환자의 불편과 고통을 해소하고자 한번

현재 임상적으로는 뇌하수체성 인간성장호르몬의 공급부족과 Creutfeldt-Jacob씨 병의 부작용으로 유전공학적 방법으로 생산된 인간성장호르몬이 단백질의 안정성을 고려하여 동결건조 시키거나, 특정 formula의 액상으로 개발되어 널리 사용되고 있다. 하지만 이들 제품은 목적한 치료효과를 얻기 위해서는 장기간 매일 투여해야 하므로 환자의 부담(고통)을 야기 시키는 문제점을 갖고 었다. 이에 생체 분해성 고분자 미렵구를 이용하는 depot 형태의 제어 방출성 삽입주사제를 개발이 요구된다. 이러한 환자의 불편과 고통을 해소하고자 한번 투여로 1개월간 약효가 지속 가능하고 약물의 생체내 이용율을 증가시킬 수 있는 인간성장호르몬 제어방출 시스템을 개발하는데 이 연구의 목적이 있다.
본 연구는 인간성장호로몬의 원료. 제조, 제제화 연구, 미립구의 특성 분석, 방출제어 시스템 평가,방출된 인간성장호르몬의 안정성 평가, 안전성 평가, 전임상시료의 생산의 연구를 그 내용으로 한다.
고순도의 인간성장호르몬을 무균적표로 생산하여 인간성장호르몬 함유 고분자 미립구 제조와 이를 위한 기초 연구의 원료로 사용하였다. 방출제어시스템 평가를 위한 in vitro 방출시험, in vivo 방출 kinetics, 뇌하수체절제 쥐를 이용한 약효평가, 물리 화학적 특성분석(RP-HPLC, SEC-HPLC, IEF등을 이용한 순도분석 및 확인시험, 봉입율, 용출시험등)등의 각종 분석방법을 확립하였다. 인간성장호르몬을 생분해성고분자 미립구에 봉입하고, 확립된 분석방법을 통해 제조된 미립구를 분석하여 그 특성과 해결하여야 문제점을 파악하고 제형의 개선연구를 수행하였다.
인간성장호르몬을 함유한 생분해성고분자 미립구를 제조하면, 그 제조과정에서 물과 유기용매의 계면 때문에 단백질의 비공유성 응집체가 많이 발생하고 이것이 지속적 방출성을 저해하는 원인이 되지만, 이런 비공유성 응집체는 조건에 따라서는 다시 풀려나올 수 었다는 것을 알았다. 따라서 제조과정에서 비공유성 응집체가 생성되는 것을 방지하거나 형성된 응집체를 다시 풀어낼 수 있는, 혹은 이 두 가지를 동시에 이룰 수 있는 방법을 찾아 제형을 개선하고자 하였다. 제형의 개선연구는 사용되는 고분자의 종류와 분자량 변화, 가역적인 응집체익 형성 및 봉입, 각종 안정화제 및 유화제등의 첨가제 사용, 제조공정 중 각 단계의 최적화 실험등의 체제화 연구를 통해 이루어졌다.
쥐와 개를 in vivo 방출 분석에서 혈중 방출은 약 15일 내외로 지속되었고 반복 투여시 매번 투여에 따른 인간성장호르몬 방출 패턴은 유사하였으며, 혈중 누적효과는 없는 것으로 나타났다. 쥐에서의 초기방출 및 생체이용율(Bioavailability )은 단백질 약물로는 최초로 개발되어 상품화된 제넨텍사의 Nutropin Depot의 보고자료에서의 값과 비교할 때, 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 판단된다. 개발된 제형으로 뇌하수체 절제 쥐에 대한 약효시험을 실시한 결과, 통일용량의 인간성장호르몬 대조군과 체중증가 속도가 유사하였으며, 비투여군 대비 유의성 있는 체중증가 및 성장판 폭의 증가를 보였다. 따라서, 인간성장호르몬 함유 고분자 미립구 내꾀 인간성장호르몬은 제조과정 중 활성의 소실없이 활성형으로 봉입되어 생체 내 투여 후 활성형으로 방출됨을 알 수 있었다.
전임상 시료의 제조를 위해 무균 제조법과 scale-up 제조공정을 확립하였고, 확립된 scale-up 제조공정에 따라 약 13g의 전임상시료를 생산하여 전임상 연구에 사용되었다. 인간성장호르몬 함유 고분자 미립구의 안전성 평가를 실시한 결과, 투여 초기에 인간성장호르몬으로 인한 면역세포의 recruit가 일어나기는 하지만 전반적으로 생체 적합성은 우수한 것으로 나타났고, 단회투여 독성 평가결과, 어떠한 임상적 이상 소견이 나타나지 않았다. 토끼를 이용한 국소 자극성 시험에서는 제넨텍사의 보고자료에서와 같이 인간성장호르몬의 항원성 때문에 공미립구에 대해서만 실시하였다. 공미립구 투여군에 대해서 염증소견이 나타났으나 이는 생분해성 고분자의 흡수를 위한 정상적인 과정으로 판단되었고, 시간이 지남에 따라 증상도 완화되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 제넨텍의 결과와 유사한 것으로 판단된다.
인간성장호르몬 함유 고분자 미립구를 냉장조건하(2~8℃)의 안정성을 검토 중에 있다. 6개월 경과시 설정해 놓은 기준에 적합하였고, 현재 계속 보존시험을 실시중이다.
본 과제의 연구수행 결과로 약 2주간 지속가능한 인간성장호르몬의 지속제형을 개발하였으며 이 제형은 인간성장호르몬의 변성없이 활성화된 형태의 인간성장호르몬을 생체 내에서 지속 방출하여 방출기간동안 효력을 나타내었다. 따라서 기존의 매일 주사해야 했던 제형의 단점을 극복하여 환자에게 사용 편의성을 줄 것으로 기대된다. 또한 본 과제를 통해 습득한 생분해성 고분자 미립구를 이용한 제어방출시스템 개발기술을 이용하여 다른 펩타이드나 단백질 약물의 제어 방출성 제제를 개발하는데 많은 기여를 할 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Deficient supply of hypothalamus derived human growth hormone(hGH) and its subsequent side effects of Creutfeldt-Jacob's disease lead to the development of genetically engineered hGH. It is used widely in a freeze dried form or a specifically liquified form for its safety. But these products have th

Deficient supply of hypothalamus derived human growth hormone(hGH) and its subsequent side effects of Creutfeldt-Jacob's disease lead to the development of genetically engineered hGH. It is used widely in a freeze dried form or a specifically liquified form for its safety. But these products have the disadvantages of having to be injected frequently in a large dose In order to have its therapeutical effects. Therefore, the development of depot controlled release system using biodegradable micro spheres was required. The purpose of this project was to develop a hGH delivery system with a release period of 1 month. The research contained the preparation of human growth hormone, formulation, microsphere chracterization, controlled release kinetics, stability of hGH, safety, and preclinical sample production.
hGH of high purity was produced and used for basic mechanism study and research of microsphere system. The analysis methods of in vitro and in vivo kinetics, RP-HPLC, SEC-HPLC, IEF, encapsulation efficiency were established. We encapsulated hGH within biodegradable microspheres, analyzed the characteristics of microspheres, and also improved the formulation.
When hGH was encapsulated within biodegradable microspheres, the hGH was aggregated on a water/organic solvent. This aggregation hindered the release, but the aggregates could be reversibly solubillized depending on a condition. Therefore, three approachesCblocking of production of aggregates, solubilization of reversible aggregates, and both) were tried to improve formulation. Improvement was performed through the change of polymer molecular weight, reversible protein aggregates production and encapsulation, use of stabilizer and surfactant, and optimization of each formulation step.
The hGH concentration in blood was sustained for over 15 days In in vivo release kinetics, and repeated injection showed similar release kinetics. They showed no cumulative effects in bloods. The value of initial burst and bioavailability was better than that of Nutropin depot CGenentech). The therapeutic efficacy against the pituitary hypothalamus removed mouse showed similar weight gain to same dose of hGH control. Therefore, the hGH encapsulated within biodegradable polymeric micro spheres maintained its funtional activity and was released in an active form even after injection.
A sterilized microsphere production method and scale-up manufacturing process were settled for preclinical sample preparation. The sample for preclinical study was produced and used according to the scale-up manufacturing process. Safety test for the polymeric microspheres containing human growth hormone showed that the microspheres has relatively good biocompatibility despite they cause some trace recruitment of immune cells. The result from single-dose toxicity test also showed no clinical aberration. Due to the immunogenecity of hGH, local stimulation test using rabbits was carried out by using blank micro spheres as reported by Genetech Co. The groups treated with the blank microspheres showed a trace of inflammation, but it turns to be normal process, which usually occurs during the absorption of biodegradable polymers. The inflammation was also alleviated as time goes on. This result agrees well with the result from Genetech Co.
The stability of the micro spheres containing hGH is being assessed at lower-temperature (2~8℃). It turns to be compatible with the previously determined standard value upto 6 months and the stability test is carrying out.
As a result of this research, sustained release formulation, which can release hGH formm the microspheres for about 2 weeks, was developed. The formulation helps maintaining the stability and effectiveness of hGH throughout the period. It is expected that the use of the formulation will give more comfort to patients, who need daily injection of hGH. It is also expected that the information from the development of the controlled release system using microspheres will contribute to the developement of controlled release formulations for other peptide and protein drugs.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목 차 ... 3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 50
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 53
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 56
• 6. 첨부서류 ... 57
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 88
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 89
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 90
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 91
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 113
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 116
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 117
• 7. 참고문헌 ... 118
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 120
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 121
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 122
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 125
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 143
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 144
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 145
• 7. 참고문헌 ... 146
• 끝페이지 ... 147