보고서 정보
주관연구기관 |
영남대학교 YeungNam University |
연구책임자 |
정태완
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참여연구자 |
박선호
,
전병학
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018090 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
인슐린.당뇨병.재조합단백질.변이단백질.Insulin.Diabetes mellitus.Recombinant protein.Mutated protein.
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초록
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본 연구과제에서는 인슐린 B 사슬 carboxy 말단의 아미노산이 threonine의 구조 이성체인 homoserine 으로 치환된 새로운 재조합 인슐린 유사체 (B30 - homoserine insulin)을 당뇨병 치료제로 개발하는 연구를 수행하였다. 이 재조합 인슐린 유사체는 B 사슬 carboxy 말단의 수산기 위치만 서로 다르기 때문에, 혈당 조절 능력을 보유하고 있을 것으로 추정하고, 현재까지 가장 널리 이용되어온 소나 돼지 등의 동물 인슐린의 장기 투여에 따른 면역반응 등 부작용을 경감사킬 것으로 판
본 연구과제에서는 인슐린 B 사슬 carboxy 말단의 아미노산이 threonine의 구조 이성체인 homoserine 으로 치환된 새로운 재조합 인슐린 유사체 (B30 - homoserine insulin)을 당뇨병 치료제로 개발하는 연구를 수행하였다. 이 재조합 인슐린 유사체는 B 사슬 carboxy 말단의 수산기 위치만 서로 다르기 때문에, 혈당 조절 능력을 보유하고 있을 것으로 추정하고, 현재까지 가장 널리 이용되어온 소나 돼지 등의 동물 인슐린의 장기 투여에 따른 면역반응 등 부작용을 경감사킬 것으로 판단하였다.
우선 (B30-homoserine) insulin 을 생산하기 위해, 인슐린 B 사슬 carboxy 말단의 threonine 대신에 methionine의 유전암호를 도입시킨 유전자에 바로 A 사슬의 유전자를 연결한 외사슬 인슐린 전구체 (single chain insulin precursor; B 사슬(1 -29)-methionine-A 사슬)의 유전자를 설계하고 이를 DNA 합성기로 제조하여 조립한 후, 대장균의 발현용 plasmid에 삽입하고 이를 대장균내에 형질전환시켜 유전자를 발현시켰다.
발현용 plasmid로는 tac promoter 지배를 받는 LacZ (β-galactosidase) 유전자, maltose-binding protein (MBP) 유전자 및 glutathion-S-transferase (GST) 유전자에 융합시 킨 pTBA, pKBA, pMAL-BA 및 pGEX-BA plasmid들을 사용하였으나, pTBA 및 pKBA plasmid의 경우 융합단백질의 분리 정제 과정에서, pMAL-BA 및 pGEX-BA plasmid의 경우 외사슬 인슐린 전구체의 생산량에서 흠이 발견되었다.
따라서, T7 promoter의 조절을 받는 pET-BA plasmid를 발현 운반체로 구촉하였다. 이 pET-BA plasmid를 재조합 대장균을 IPTG로 유전자 발현을 유도한 결과, 외사슬 인슐린 전구체의 융합 단백질이 재조합 대장균 세포 전체 단백질의 30%를 차지하였다. 이 융합 단백질은 세포내 불용성의 inclusion body로 생성되었으므로, 6M urea로 용출한 후 nickel-affinity chromatography를 이용하여 분리하여, 재조합 대장균 배양액 1ℓ 당 평균 80mg의 외사슬 인슐린 전구체의 융합 단백질을 얻을 수 있었다. 이 융합 단백질을 cyanogen bromide로 methionine 잔기를 절단한 후, 반응산물은 다시 nickel-affiniη chromatography로 분리하고, 분리된 인슐린 A 사슬 및 30위에 homoserine을 지닌 B 사슬 혼합물은 sodium sulfite 와 sodium tetrathionate dihydrate 로 oxidative sulfitolysis를 실시한 후, β mercaptoethanol로 재조립하여 최종 산물인 B30 homoserine inslum을 얻었다. 반응액은 고속 정제용 액체 크로마토그래피(FPLC)로 분리 정제하였으며, 얻어진 B30-Hse 인슐린 유사체에서, cyanogen bromide 절단 후 회수율은 이론치의 75%, 재조립 수율은 약 60% 에 달했다. 따라서, 최종 목적물인 B30-Hse 인슐린 유사제는 재조합 대장균 배양액 1ℓ 당 평균 20mg을 얻을 수 있었다.
한편, 새로운 재조합 인슐린 유사체의 경제적인 고농도 발효 및 분리 정제 공정에서는 유가배양, 연속배양 및 two-stage cyclic fed-batch(TCF)를 통한 재조합 대장균의 고농도 배양을 설시하였다. 유전자 산물의 생산량을 비교해 본 결과, TCF의 공정에서 B30-homoserine insulin precursor의 융합 단백질 량이 310mg fusion insulin/L로 유가배양 및 연속배양의 값보다 약 2배 이상 높게 나타났다. 뿐만 아니라, 유가배양 시 initial medium에서 glucose의 농도가 10g/L, yeast extract 농도 10g/L일 때 최적의 비성장속도를 나타내 었으며, specific growth rate 0.30hr-2 의 조건에서 부피당 생산량이 최고에 도달하였다. 이 때 생산된 재조합 융합 단백질 량은 유가 배양액 1ℓ 당 150mg로써 회분식 배양에 비해 2배 정도 많이 생산되었다. 발효 시스템의 컴퓨터 제어에 의한 자동화를 위해 D/A converter를 이용하여 배양과정 중의 CO2 배기가스의 배출특성 실험을 수행한 결과, IPTG에 의한 유전자 발현의 유도에 상관없이 CO2 배기가스 배출량은 재조합 대장균의 성장과 거의 일치하는 결과를 나타내었다. 따라서, 배양 중의 CO2 농도를 on-line으로 측정 함으로써 cyclic fed-batch system의 induction time, concentration 및 transfer time 등을 효과적으로 제어할 수 있다는 사실을 확인하였다.
이 렇게 생산된 B30 - homoserine insulin precursor의 융합 단백질은 nickel-affinity column을 이용한 affinity chromatography로 대량 정제를 시도하였다 6M urea 용출 여과액 1㎖을 column에 loading하고 l㎖/min 의 유속으로 6M Urea가 포함된 pH7.9의 1X binding buffer, 1X wash buffer, 1X elute buffer로 추출하였을 때, His-tagged B30- homoserine 인슐린 유사체의 고순도 분리 정제 수율은 45mg/ℓ 로 30% 이상으로 나타났다.
인슐린 효능 검색법으로 mouse에서 분리된 3T3-L1 preadipocyte를 지방세포로 분화시켜서 인슐린에 의한 당 수송능을 측정하는 방법, 세포막의 당 운반체인 GLUT4의 세포막으로의 이동 (translocation)에 미치는 영향을 조사하는 방법, 인슐린 수용체와 인슐린의 결합에 의한 signaling cascade에 의한 tyrosine kinase activity에 따른 단백 질들의 tyrosine pattem의 변화를 측정하는 방법, 기존의 streptozotocin에 의해 유도된 당뇨 쥐의 혈당 강하 작용을 측정한은 방법들을 개발하여 비교 분석하였다. 이러한 인슐린 검색 모델 시스템에서 인간의 재조합 인슐린과 소의 인슐린의 효능을 비교한 결과, 두 인슐린간에 큰 차이점을 발견할 수 없었다.
이 중 분화시킨 3T3-Ll preadipocyte 지방세포에서의 당 수송능을 조사하여, 본 연구과제에서 제조한 B30 homoserine insulin의 효능을 관찰한 결과, 시판되는 재조합 인간 인슐린보다 효능이 다소 낮다는 사실을 알 수 있었다. 이는 아마도 새로운 인슐린의 분리 정제 단계에 흔입된 불순물에 의해서이거나, 아니면 변이된 아미노산에 의한 영향으로 추정되나, 앞으로 보다 많은 량의 B30 homoserine insulin을 생산하여, 그 기작을 규명해야 될 필요성이 있다.
이상에서와 같이, 본 연구과제에서는 새로운 당뇨병 치료제로써 인슐린 B 사슬 carboxy 말단에 methionine 으로 치환된 B30 - homoserine insulin을 생산하기 위해, 유전자 설계, 발현 운반체로의 도입, 재조합 대장균에서의 유전자 발현 유도, 융합 단백질의 분리 정제, cyanogen bromide에 의한 A 사슬 및 B 사슬의 분리, oxidative sulfitolysis 및 refolding에 의한 B30-homoserine insulin으로의 재조립을 성공리에 마쳤다. 그리고 생산 공정 수립을 위한 재조합 대장균의 고농도 배양 및 대량 분리 정제 공정도 확립하였다. 이렇게 제조된 B30-homoserine insulin 의 효능을 검증한 결과, 기존의 재조합 인간 인슐린보다 다소 낮은 효능을 나타내었는데, 이는 앞으로 분자 수준에서 더 연구를 하여야 할 것이다.
Abstract
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This project was conducted for a new anti-diabetic insulin analog having homo serine at B30 position, which is a structural· isomer of threonine at B30 of human insulin. Thus this B30-homoserine insulin only differs in the attached site of hydroxyl group, which gives
This project was conducted for a new anti-diabetic insulin analog having homo serine at B30 position, which is a structural· isomer of threonine at B30 of human insulin. Thus this B30-homoserine insulin only differs in the attached site of hydroxyl group, which gives some expectation of its regulating activity of blood glucose and decreased toxicity like allergenicity followed by long-term treatment of animal insulins.
Firstly, the gene for single chain insulin precursor was designed by direct linking insulin B chain gene replaced threonine codon with methionine codon at B30 position with insulin A chain gene, under the assumption that methionine residue will be converted into homo serine during cyanogen bromide treatment. The gene was synthesized, assembled, and inserted into some E. coli expression vectors.
The employed expression vectors were pTBA, pKBA, pMAL -BA and pGEX -BA plasmid, of which gene expression was controlled by tac promoter. The expressed protein was fused with LacZ (β -galactosidase) in pTBA and pKBA plasmid, maltose-binding protein (MBP) in pMAL-BA plasmid, and glutathion-S-transferase (GST) in pGEX -BA plasmid. However, the fused proteins from pTBA and pKBA plasmid gave some problems in separation and purification. And, the production of fused proteins from pMAL-BA and pGEX -BA plasmid was too low due to larger part of MBP and GST compared to single chain insulin precursor.
A new expression vector, pET-BA plasmid, was constructed, which can be regulated by T7 promoter. When the gene in host E. coli BL211(DE3)pLysS was induced by IPTG (isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside), the fused protein of single chain insulin precursor was produced as much as 30% of total cell protein. When this fused protein in inclusion body was dissolved in 6M urea and loaded on nickel-affinity column, about 80mg of fused protein was separated from 1ℓ of cell culture broth. The separated fused protein was then subjected to cyanogen bromide treatment for cleaving methionine residue, and the resulting B30 homo serine chain and A chain was purified again by nickel-affinity chromatography. The mixture of two chain was then reacted with sodium sulfite and sodium tetrathionate for oxidative sulfitolysis, and followed by the reconstitution by β -mercaptoethanol. From the finally obtained reaction mixture, the refolded B30-homoserine insulin was purified through fast preparative liquid chromatography (FPLC). The reaction yield was 75% of theoretical amount in cyanogen bromide cleavage, and 60% in oxidative sulfitolysis and reconstitution. The resulting B30-homoserine insulin was purely separated as much as 20mg from 1ℓ of cell culture.
In order to investigate high-density recombinant cell culture system, fed-batch culture, continuous culture and two-stage cyclic fed-batch (TCF) culture were attempted. In the viewpoint of productivity, TCF process gave the fused protein of B30-homoserine insulin precursor as much as 310mg fusion insulin/L, which was 2 times higher than fed-batch or continuous process. In fed-batch culture, the maximal specific growth rate was achieved when the concentration of glucose and yeast extract was 10g/L in initial medium, and the maximal volumetric productivity obtained when the specific growth rate was 0.30hr-1 reached to 150㎎ of the fused protein from Iℓ culture broth, which is 2 times higher than batch culture. For the establishment of automated fermentation system by computer, the exhausted CO2 concentration during cell culture was measured by D/A converter. It was found that the amount of exhausted CO2 gas was well correlated with cell growth, regardless IPTG induction of gene expression. It means that CO2 concentration exhausted during fermentation will be measured by on -line and employed in controlling induction time, cell concentration and transfer time in TCF system.
The large-scale purification of the produced fused protein of B30-homoserine insulin precursor was also tried using nickel-affinity column chromatography. One 1㎖ solution dissolved in 6M urea was loaded on nickel-affinity column, and separated with the flow rate of 1㎖/min of IX binding buffer, IX wash buffer, and IX elute buffer in tum. The recovery amount of the fused protein was calculated as 45㎎/ℓ in the yield of 30%.
Several detecting procedures for insulin efficacy was developed and established. Those are measuring method of the transported glucose concentration into differentiated mouse 3T3-Ll preadipocyte cell, test for the tranlocation of GLUT4, one of glucose transporter, into cell membrane, detecting method of the change of tyrosine pattern in protein by tyrosine kinase activity followed by signaling cascade of insulin-insulin receptor binding. and well-known convulsion test by hypoglycemia in strepto2otocin-induced diabetic mouse. When all of the above test methods were employed, any significant differences were not found between bovine insulin and recombinant human insulin.
Using the system for glucose transportation into differentiated 3T3-L1 preadipocyte, the efficacy of B30-homoserine insulin was examined. The result shows that B30-homoserine insulin has somewhat lower activity than bovine insulin and recombinant human insulin. It might be due to the impurity in B30-homoserine insulin preparation, or the effect of mutated homo serine residue. Further study is required for the exact molecular elucidation of B30-homoserine insulin action.
In conclusion, the designed and constructed gene for B30-homoserine insulin was successfully expressed in E. coli. The gene product fused with His-tag was well separated by nickel affinity column chromatography, and subjected to cyanogen bromide cleavage, oxidative sulfitolysis, and reconstitution. And, the fermentation process for scale-up operation was also established by high-density recombinant cell culture, and large-scale separation process was tried. Even though the prepared B30-homoserine insulin showed somewhat lower activity than other commercial insulins, further study will give some solutions about this result. Good results will be anticipated.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 목차 ... 3
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
- Project Summery ... 7
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 18
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 21
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 26
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 28
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 29
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 31
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 37
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 47
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 49
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 50
- 7. 참고문헌 ... 51
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 53
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 54
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 56
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 60
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 69
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 71
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 72
- 7. 참고문헌 ... 73
- 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 75
- 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 76
- 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 78
- 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 80
- 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 86
- 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 88
- 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 89
- 7. 참고문헌 ... 89
- 끝페이지 ... 91
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