초록 ▼

▣ 연구내용 및 결과
1. 중앙세포주의 세포 밖 단백질 분석
HT1080과 LoVo 종양세포의 세포 밖 단백질을 분석한 결과, 세포질과 핵에서만 존재하는 것으로 알려줬던 hsp70과 Nm23 이 세포 밖에서도 존재하는 것을 본 연구에서 밝혔다. 또한 종양 전이에 중요한 인자인 MMP2와 TIMP2도 분리하여 분석하였다.
➀ hsp70
heat shock을 가하였을 때 hsp70의 세포 외 분비량은 증가하였으며, 세포질에서 관찰되지 않던 46, 35 및 28kDa 분자량의 hsp70 유사체들이 검출되었다.

▣ 연구내용 및 결과
1. 중앙세포주의 세포 밖 단백질 분석
HT1080과 LoVo 종양세포의 세포 밖 단백질을 분석한 결과, 세포질과 핵에서만 존재하는 것으로 알려줬던 hsp70과 Nm23 이 세포 밖에서도 존재하는 것을 본 연구에서 밝혔다. 또한 종양 전이에 중요한 인자인 MMP2와 TIMP2도 분리하여 분석하였다.
➀ hsp70
heat shock을 가하였을 때 hsp70의 세포 외 분비량은 증가하였으며, 세포질에서 관찰되지 않던 46, 35 및 28kDa 분자량의 hsp70 유사체들이 검출되었다.
➁ Nm23
세포 밖 Nm23은 NDP kinase 효소 활성을 보유하였으며 자가 인산화되고, heterogeneous heterohexamer의 형태로 존재한다는 점은 세포질 Nm23과 유사하였으나, 세포 밖 Nm23의 경우 H1 동위형이 H2 보다 많은 점이 세포내 Nm23 과 달랐다. 세포 밖 Nm23의 경우 H1 동위형이 H2 보다 많은 점이 세포내 Nm23 과 달랐다. 세포 밖 Nm23의 효과를 보고자 Nm23을 media에 첨가하였을 때, 세포의 motility가 크게 감소함이 알 수 있었다. 이는 MMP activity를 저해하여 일어나는 현상임을 밝혔다.
➂ MMP2/T IMP2
HT1080 세포로부터 세포 밖 단백질에 대하여 gelatin affinity column chromatography를 이용하여 MMP2 와 TIMP2를 분리하였는데, TIMP2의 양이 MMP2 양의 1.5-3배 많이 존재하는 것으로 나타나 MMP2.TIMP2가 1:1 몰비로 존재한다는 연구결과에 의문을 갖게 되었다. 이때 MMP2/TIMP2 혼합체는 효소활성을 갖지 않았으며, MMP2의 자가활성화 역시 TIMP2와의 결합에 의해 저해됨을 확인하였다
II. Nm 과다 발현 세포의 serum starvation에 의한 세포안/밖의 변화 조사
Nm23 과다 발현 세포주에서 차등 발현되는 단백질을 20-gel electrophoresis를 이용하여 스크리닝한 결과, 아무런 신호를 주지 않았을 때 세포질 내의 Nm23-H1, FAF1, hsp 등은 차등 발현되었으나, 세포 밖 hsp70 의 발현량에는 변화가 없었다. Serum starvation 후에 proteomics 분석을 수행한 결과 vimentin, tubulin, ATP synthetase, hsp27, Nm23등의 발현이 감소됨을 관찰하였다.
III. 고전이능 세포주 간의 DO-PCR을 이용한 차등발현 분석
In vivo experimental metastasis를 통해 선택된 고전이능 세포주인 mouse melanoma B16 variant들과 in vitro invasion selection을 통해 확보된 LoVo variant 들로부터 이들의 대조군 세포주와 비교하여 차등 발현되는 mRAN를 검색을 diffrential display 방법에 의해서 수행한 결과 human protein phosphatase- 1 gamma 와 rat 26S proteasome p112 subunit에 높은 유사성을 갖는 유전자의 발현이 고전이능으로 갈수록 감소함을 관찰할 수 있었다.
IV. 고전이능 세포주 간에 암전이 (참윤, 접착, 이동) 및 세포사멸 관련 유전자들의 발현 수준 비교
B16 variant에서의 암전이 관련 유전자 (Nm23, TIMP2, autotaxin), cell adhesion 관련 유전자(a -, ß -, ɤ -catenin) 및 세포사멸 관련 유전자 (ALG-2, FAF1, Daxx, FADD, Bcl-2)에 대한 Northern 분석 결과, 세포사멸인자인 ALG-2와FAF1은 고전이능 세포주에서 발현양이 감소되었으며, 그 외의 인자들에서는 변화를 볼 수 없었다.
V. 세포사멸인자 hFAF1의 분자적 특성 규명
고전이능 세포주에서 차등적으로 발현되는 세포사멸 인자인 human Fas associated factor 1에 대하여 조직 분포 양상을 조사한 결과, 대부분의 조직에서 발현되었으며, 특히 testis, skeletal muscle과 heart에서 높은 발현을 보였다. 또한 456bp의 in-frame interal deletion이 있는 cDNA [hFAF1(S)]가 HeLa 와 liver에 존재함을 밝혔다. 그리고 two-hybrid assay와 in vitro protein binding 등에 의하여 hFAF1의 아미노산 1-201이 Fas와의 결합 domain으로 mapping 되었다.

Abstract ▼

▣ Research Contents and Results
I. Analysis of extracellular proteins from cancer cell lines
By the analysis of extracellular proteins from HT1080 and LoVo, this study demonstrated extracellular presence of hsp70 and Nm23 know to exist only in the cytosol and nucleus. Also MMP and TIMP2, impor

▣ Research Contents and Results
I. Analysis of extracellular proteins from cancer cell lines
By the analysis of extracellular proteins from HT1080 and LoVo, this study demonstrated extracellular presence of hsp70 and Nm23 know to exist only in the cytosol and nucleus. Also MMP and TIMP2, important factors in metastasis, were purified and analyzed.
➀ hsp70
With heat shock, the amount of hsp70 extracellularly secreted was increased and hsp homologs with 46, 35 and 28 kDa which were not discovered in the cytosol were found.
➁ Nm23
Extracellular Nm23 was similar to cytosolic Nm23 because it retained NDP kinase activity, was autophosphorylated, and existed as heterogeneous heterohexamers except having more H1 than H2, which was otherwise in the cytosol. Addition of Nm23 in the media in order to see the effect of extracellular Nm23 in the media in order to see the effect of extracellular Nm23 caused dramatic decrease in cell motility. This study proved that the inhibition of MMP activity by Nm23 brought about this phenomenon. countinued in the next page
➂ MMP2/T IMP2
MMP2 and TIMP2 were purified by gelatin affinity column chromatography from extracellular proteins of HT1080 cells. Previous result that MMP2/TIMP2 existed 1:1 molar ratio was questioned since our data showed that TIM2 was more abnundant than MMP2 by 1.5 - 3 fold. The MMP2/TIMP2 complex did not have enzyme activity and autoactivation of MMP2 was prevented by TIMP2 as well.
II. Cytosolic vs extracellular change of Nm23 overexpressing cells by serum starvation
Cytosolic Nm23-H1, FAF1 and hsp were differentially expressed in the Nm23 over-expressing cell but no change was detected in the extracellular hsp70 by 2D-gel electrophoresis analysis without any signal. However, vimentin, tubulin, ATP synthase, hsp70 and Nm23 decreased with serum starvation.
III. Differential expression analysis by DD-PCR in metastatic cancer cells
Mouse melanoma B16 variants selected by in vivo experimental metastasis and LoVo variants selected by in vitro invasion were compared to their controls by DD-PCR. mRNAs with decreased expression in metastatic cells were identified as mouse homologs of human protein phosphatase - 1 gamma and rat 26S proteasome p 112 subunit, respectively.
IV. Comparison of expression leve is of metastasis (invasion, adhesion, motility)- and apoptosis-related genes in metastatic cancer cells
Northern analysis of metastasis genes(Nm23, TIMP2, autotaxin), cell adhesion genes (a -, ß -, ɤ -catenin) and apoptosis genes(ALG-2, FAF1, Daxx, FADD, Bcl-2) revealed down regulation of ALG-2 and FAF1 in metastatic cells. But expression of other genes were not changed.
V. Molecular character istics of apoptotic factor, hFAF1
Tissue distribution analysis of differentially expressed apoptotic factor, human Fas associated factor 1, showed expression in every tissues tested. Testis, skeletal muscle and heart showed high expression. And hFAF1(s) cDNA with 456bp in-frame internal deletion was detecthed in HeLa and liver. And a.a. 1-201 of hFAF1 was mapped as Fas binding domain by two hybrid assay and in vitro protein binding.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 18
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 21
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 24
• 6. 첨부서류 ... 25
• 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 26
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 27
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 30
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 32
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 43
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 45
• 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획 ... 47
• 7. 참고문헌 ... 47
• 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 90
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 91
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 93
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 96
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 104
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 107
• 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획 ... 109
• 7. 참고문헌 ... 110
• 끝페이지 ... 146