초록 ▼

○ 연구결과
제1세부과제는 배양한 대뇌피질 신경세포와 선조체 신경세포에서 신경성장들은 혈정결핍에 의한 apoptosis를 효과적으로 억제하였지만 excitotoxicity, free radical에 의한 necrosis를 억제하지 못했고, 특이적으로 free radical에 의한 세포손상을 오히려 증폭시킨다는 것을규명하여 신경성장인자는 세포사멸형태에 선택적으로 보호효과가 나타난다는 것을 입증하였다.
제2세부과제는 배양한 대뇌피질 신경세포에서 신경성장인자 insulin이 apoptosis를 억제하는 기전이 세포내 신호전달

○ 연구결과
제1세부과제는 배양한 대뇌피질 신경세포와 선조체 신경세포에서 신경성장들은 혈정결핍에 의한 apoptosis를 효과적으로 억제하였지만 excitotoxicity, free radical에 의한 necrosis를 억제하지 못했고, 특이적으로 free radical에 의한 세포손상을 오히려 증폭시킨다는 것을규명하여 신경성장인자는 세포사멸형태에 선택적으로 보호효과가 나타난다는 것을 입증하였다.
제2세부과제는 배양한 대뇌피질 신경세포에서 신경성장인자 insulin이 apoptosis를 억제하는 기전이 세포내 신호전달분자 중 PI-3K의 활성을매개로 일어난다는 것을 규명하였다.
insulin은 apoptosis를 억제하는 작용과 더불어 free radical injury는 더 악화시키는 효과가 있는데 이러한 작용도 PI-3 K의 활성이 관여되었다는 것을 알았다. 또한 세포사멸과정에 관여하는 것으로 알려진 protein kinase 중에서 MARKs 즉 JNK(SAPK) 또는 p38-MAPK가 apoptosis과정동안 활성화되고, JNK, p38-MAPK의 활성화는 apoptosis를 억제할 수 있는 단백질 합성 억제제, 신경성장인자 BDNF, insulin, 또는 apoptosis 동안 활성화되는 것으로 알려진 protease 중 caspase의 억제제에 의해 억제되는 것을 알았다.
또한 신경성장인자에 의해 발현이 조절되는 세포내 분자를 동정하기 위해서 differential display 방법을 사용해서 BDNF, NT-3,NT-4/5를 각각 처리한 신경 세포에서 대조군에 비해 발현이 증가하는 RNA를 분석하였다. 아직까지 그 기능이 알려지지 않은 것외에 CRMP-1(collapsin response mediator protein)의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
제3세부과제는 대뇌피질 신경세포에서 아연은 free radical에 의한 necrosis를 유도하고 신경성장인자는 아연독성을 증폭시킨다는 것을 알아냈다. 또한 세포내 Ca²⁺ 농도를 선택적으로 낮추거나 높였을 때 신경세포의 apoptosis가 유도되며, 농도를 높이면 Ca²⁺ 및 Na⁺의 세포내 유입으로 신경세포는 necrosis로 사멸하는 것을 발견하였다. 신경성장인자는 apoptosis는 효과적으로 억제하였지만 necrosis는 억제하지 못하는 것을 규명하였다. 세포내 Ca²⁺ 농도를 낮추었을 때 신경성장인자의 보호효과는항산화제의 존재하에 더욱 증가하였다. 이러한 결과는 제 1세부과제의 결과와 일치함을 확인하였다.
제4세부과제는 해마절편을 이용해서 신경성장인자 BNDF는 뇌신경세포의 생리적 제 현상, 즉 막전위, 막저항, membrane time consant, spike threshold, spike size에 영향을 미치지는 않지만 presynaptic terminal에 작용하여 신경전달물질의 방출과, EPSP를 증가시키는 것을 규명하였다. 또한 LTP와는 다른 경로를 통해 synaptic transmission이 증가하는 것을 규명하였다.
제5세부과제는 생체내 신경세포손상 모델로 흰쥐 뇌의 해마에 kainate(KA), 또는 microtubule association을 억제시키는 colchicine을 투여하는 방법을 확립하였다. kainate 투여에 의해 신경세포손상은 necrosis형태이며, cycloheximide나 신경성장인자 insulin에 의해 세포 사멸이 조절되지 않음을 알았다. 하지만 colchicine에 의한 신경세포사멸은 해마 중 dentategyrus의 granule cell만 선택적으로 일어나며, 전형적인 apoptosis 임을 알았고, 이러한 세포사멸은 cyclohexinide나 신경성장인자 insulin에 의해 효과적으로 억제됨을 규명하였다.
본 연구과제는 신경성장인자의 세포사멸조절 작용이 사멸의 형태(즉, apoptosis vs necrosis)에 의존한다는 것을 in vitro와 in vivo 실험을 통하여 명확히 입증하였다. 따라서 신경성장인자의 신경세포보호 기능을 극대화하기 위해서는 항산화제나 gluatamate antagonist와 병용해야 할 필요성을 입증하였다.

Abstract ▼

Neurotrophic factors play a central role in development and maintenance of the nervous system. Accumulating evidence suggests that neurotrophic factors are merited to treat acute and chronic brain diseases including stroke, Alzheimer' s disease, and Parkinson’s disease by preventing neurodegenerativ

Neurotrophic factors play a central role in development and maintenance of the nervous system. Accumulating evidence suggests that neurotrophic factors are merited to treat acute and chronic brain diseases including stroke, Alzheimer' s disease, and Parkinson’s disease by preventing neurodegenerative process and promoting regenertation. However, this idea has been challenged by recent reports that those growth factors may worsen neuronal injury under certain circumstances. The present study was aimed to delineate precise role of neurotrophins and insulin-like growth factors in regulating neuronal death and function in vitro and in vivo.
Neuronal death can be classified into excitotoxicity, free radical neurotoxicity, and apoptosis based upon triggers and executioners of death, morpohology of degenerating neurons, and interventional criteria. For example, cortical cell cultures exposed to serum deprivation, calyculin A, or cyclosporine A undergo apoptosis featured by cell body shrinkage, aggregation and condensation of nuclear chromatin, and fenestration of nuclear membrane prior to plasma membrane. This apoptotic cell death is prevented by cycloheximide, a protein synthesis inhibitor, neurotrophins or insulin-like growth factors, but by neither glutamate antagonists nor antioxidants. In contrast, free radicals produce necrosis of cortical and straital neurons in a way sensitive to anti-oxidants and insensitive to cycloheximide. Neurotrophins and insulin-like growth factors markedly potentiates free radical-induced neuronal necrosis.
Therefore, neuroprotective potential of growth factors seems to be limited to apoptosis and maximized in the presence of anti-oxidants. In the adult rat, NT-4/5 and insulin selectively attenuate neuronal apoptosis induced in the hippocampal formation following treatment with colchicine without beneficial effects against kainate-induced neuronal necrosis. Treatment with neurotrophins increased NMDA- and non-NMDA- currents ín the CAl field of the hippocampal formation. This action of neurotrophins is associated with decrease in paired-pulse facilitation (PPF) 과 post-tetanic potentiation(PTP), suggesting the presynaptic modulation of synaptic transmission by neurotrophins. It is of special interest that the enhanced excitatory transmission by neurotrophins underlies anti-apoptosis and pro-necrosi action of the growth factors.
Action of neurotrophins that attenuates apoptosis and potentiates free radical toxicity depends upon activity of PKC while insulin-like growth factors regulate neuronal death through activation of PI-3K, not PKC.Activation of p38 MAPK is required for execution of neuronal apoptosis, neither excitotoxicty nor Zn²⁺ neurotoxicity, and suppressed by inclusion of BDNF or insulin, suggesting that neurotrophins and insulin-like growth factors attenuate apoptosis presumably by inhibiting upstream pathways of p38 MAPK. While selective accumulation and chelation of intracellular Ca²⁺ produce neuronal apoptosis, these changes in Ca²⁺ are not recovered by addition of neurotrophins and insulin-like growth factors that prevents apoptosis.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구개발 최종보고서 ... 2
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• 영문요약문 ... 6
• 목차 ... 7
• 제1장 서론 ... 8
• 제1세부과제 (곽병주) ... 8
• 제2세부과제 (주일로) ... 8
• 제3세부과제 (조은혜) ... 9
• 제4세부과제 (정민환) ... 9
• 제5세부과제 (허균) ... 10
• 제2장 국내ㆍ외 기술개발 현황 ... 11
• Excitotoxicity에 의한 신경세포의 사멸 ... 12
• Free radical에 의한 세포사멸의 양상 ... 12
• Neurotrophins에 의한 세포사멸조절 및 신호전달체계 ... 12
• Insulin-like growth factors에 의한 세포사멸조절 및 신호전달체계 ... 13
• 신경성장인자들에 의한 세포사멸조절의 매개 유전자: CREB ... 13
• 신경성장인자들에 의한 생리작용 조절 ... 14
• 선경성장인자들에 의한 세포사멸조절 ln vivo ... 14
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 15
• 제1절 실험방법 ... 15
• 제2절 연구내용 및 연구결과 ... 18
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 30
• 제1세부과제 ... 30
• 제2세부과제 ... 30
• 제3세부과제 ... 30
• 제4세부과제 ... 31
• 제5세부과제 ... 31
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ... 33
• 가. 계량적 성과 ... 33
• 나. 성과내용기술 ... 33
• 다. 활용계획 ... 35
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 36
• 제7장 참고문헌 ... 37
• 최종보고서 요약(초록) ... 43
• 끝페이지 ... 44