초록 ▼

○ 연구결과
1) 토마토풋마름병 피해현황조사
토마토풋마름병은 전국 재배지역에서 재배작형에 관계없이 발생하여 큰 피해를 주고, 최근에는 겨울과 이른 봄 기온이 상승하여 시기에 관계없이 발생되고있다. 병이 발생한 농가에서는 기존의 살균제나 마이신계통의 농약을 엽면살포하거나 주기적으로 관주하여도 방제되지 않았다. 대부분 농가들은 토마토풋마름병예방을 위해 저항성대목을 이용한 접목묘를 정식하여 재배하고있으나 재배년수가 길어짐에 따라 병원균밀도가 증가하여 병발생이 증가하고있다. 병이 발생한 농가는 전염속도가 빨라 경제적 손실이 막대

○ 연구결과
1) 토마토풋마름병 피해현황조사
토마토풋마름병은 전국 재배지역에서 재배작형에 관계없이 발생하여 큰 피해를 주고, 최근에는 겨울과 이른 봄 기온이 상승하여 시기에 관계없이 발생되고있다. 병이 발생한 농가에서는 기존의 살균제나 마이신계통의 농약을 엽면살포하거나 주기적으로 관주하여도 방제되지 않았다. 대부분 농가들은 토마토풋마름병예방을 위해 저항성대목을 이용한 접목묘를 정식하여 재배하고있으나 재배년수가 길어짐에 따라 병원균밀도가 증가하여 병발생이 증가하고있다. 병이 발생한 농가는 전염속도가 빨라 경제적 손실이 막대하였고, 병발생이 심한 농가는 방제방법이 없어 토마토농사를 포기하여 이를 해결할 수 있는 대책마련이 시급히 요구되고있었다.
2) 길항균주 분리
토마토풋마름병과 배추무름병방제를 위해 Pseudomonas속, Bacillus속, 방선균류를 토양에서 분리하였다. 채집한 토양은 0.85%생리식염수에 연속희석법으로 희석하여 각 배지에 접종하여 분리하였다. 분리․동정된 Pseudomonas fluoresens, P. putida, P. synxantha, P. auranthica, P. marginaris는 King's medium B agar배지에서, Bacillus subtilis, B. lichenformis는 토양을 멸균수에 희석한 후 90℃로 열처리한 후 접종배양한 Nutrient agar에서, Streptomyces griseus는 Chitin agar배지에서 각각 분리하였다. 토마토풋마름병방제용 미생물농약개발을 위해 분리한 S. griseus0104균주는 DDBJ/ NCBI/Genebank와 Ribosomal Database ProjectⅡ의 database에서 상동성검색을 수행한 결과, Streptomyces 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서 Streptomyces griseusATCC25497^T (D63872)와 99.83%의 유연관계를 나타내었다.
3) S. griseus0104의 항균물질생산능
S. griseus0104은 PD broth나 Nutrient broth와 같은 영양배지에서 항균물질생산력이 낮았으나
기영양원을 공급하고 glycerol, glucose, soybean, NaCl을 첨가한 액체배지에서 배양하였을 때토마토풋마름병원균에 대해 항균력이 있는 물질을 생산하였다. S. griseus0104가 생산한 항균물질은 유기용매로 정제되지 않고 Amberite IRC-50에 흡착시킨 후 황산용액으로 추출하여 분리되었다. 정제된 항균물질은 Oxolinic acid와 비슷한 항균활성을 보였다.
4) S. griseus0104의 토양 내 정착능 및 풋마름병원균 억제효과
실험에 사용된 토양의 방선균 밀도는 1X10⁴ cfu/g.soi1이었다. 시판하는 포대퇴비를 시험토양에 넣고 수분을 유지하면서 병원균밀도변화를 조사한 결과 무처리구의 병원균밀도는 꾸준히 증가하여 26일 후에는 4.7X10⁶ cfu/g.soil로 400배 이상 증가하였다. S. griseus0104를 10⁶ cfu/g.soi농도로 접종한 시험구의 토양 내 풋마름병원균 밀도는 10～40cfu/g.soil로 무처리구 병원균밀도의 1/10,000수준으로 낮아졌다. 조사기간 중 병원균밀도 증가는 토양에 있는 토마토뿌리잔재물 내부에 있던 병원균이 토양으로 유출되어 증가된 것으로 확인하였다
5) S. griseus0104 제품생산을 위한 제형기술개발
S. griseus0104를 액체배양하면 Nutrient broth와 Potato dextrose broth에서 왕성하게 자랐으나 균체를 수확하여 건조시키면 모두 사멸하였다. 액체배양시 균첼를 수확하여 건조시킬 수 있는 배지는 무기영양원에 chitin을 첨가하여 준비한 CB broth에서만 균사가 균사분체로 전환되어 동결건조에 의해 건조가 가능하였다. S. griseus0104의 포자유도는 고체배지에서만 가능하였고 감자추출물에 무기영양원을 첨가한 고체에서 10일간 배양하여 2X10⁶ spores/㎖씩 포자를 수확하였다. 고체배지에서 배양한 포자는 물로 수확하면 포자가 뭉치고 물에 떠 손실이 많았으며 이를 해결하기 위해 세제를 1%로 희석하여 배양한 plate에 부은 다음 30분간 정치하면 포자가 쉽게 가라앉자 수확이 용이하였다. 세제로 수확한 포자는 발아율, 물리적, 화학적 외부손상에 영향을 받지 않았다. 수확된 포자를 탈지분유에 현탁하여 동결건하면 40℃에서 50일간 저장하면 0.04%의 생균수손실이 있었으나 상온에서는 손실이 거의없고 1년이상 보존이 가능하였다.
6) 토마토풋마름병방제효과조사
풋마름병원균의 활력이 가장 왕성한 7월 중순 고온기에 토마토풋마름병 피해를 입은 농가에서 실생묘와 접목묘를 정식하여 S. griseus0104의 방제효과를 조사하였다.
실생묘를 정식한 시험구에서 무처리구는 정식 20일 후에 모두 고사하였으나 S. griseus0104를 정식시 침지처리하고 5일간격으로 3회 처리한 처리구는 5단 수확까지 발병율이 7.6%로 낮았으며, chitin을 부재로 첨가한 S. griseus0104처리구는 6단 수확까지 2.3%의 낮은 발병율을 보였다. 저항성대목에 실생묘를 접하여 정식한 시험구의 무처리구는 3단 수확까지 25.7%의 발병율을 보이고 S. griseus0104를 3회 관주한 시험구에서는 7단 수확까지 0～0.2%의 낮은 발병율을 보였다. 병이발생한 토마토의 2/3이상이 Fusarium oxysporum에 의한 반신위조병으로 확인되었다.
7) S. griseus0104 제형제품 토양살포에 의한 풋마름병방제효과조사
S. griseus0104를 제형화한 입제, 분말수화제, 액상수화제를 이병된 도양에 처리하여 병원균밀도 감소효과를 조사한 결과 3종 모두 무처리구에 비해 병원균밀도가 감소하였으며 입제처리구에서의 감소가 현저하였다. 특히 입제의 포자밀도를 10⁷ spores/g으로 높여주면 수확종료까지 병발생이 없었다. 입상수화제는 10⁸ spores/g으로 조제하여 처리한 처리구에서 2단 수확까지는 병이 발생하지 않았으나 4단 수확기에 20% 발생하여 약효지속성이 약하였다.
8) 토마토풋마름병방제용 기능성퇴비제조
토마토재배농가에서 많이 사용하는 우분의 퇴비기능성을 높이기 위해 퇴비제조실험을 수행하였다. 우분을 발효시키면 자체에 토마토풋마름병원균의 생장을 억제시키는 기능이 있어 발효시킨 우분퇴비를 물로 추출하여 항균력을 조사하면 1.3mm정도의 저지원이 형성되었다. 우분에 콩대공등 농산부산물을 첨가하여 만든 퇴비는 발효속도가 빨라지고 토마토풋마름병억제력이 향상되었다. 퇴비온도가 45℃이하로 떨어졌을 때 S. griseus0104와 당밀을 살포하여 제조한 퇴비를 발병된 밭에 2년간 살포한 결과 발병율이 0.01%이하로 정상수확이 가능하게되었다.
9) 토양처리용 입제, 관수처리용 입상수화제 체계처리효과
토마토풋마름병방제를 위해 S. griseus0104를 원제로 토양살포용 입제와 재배기간 중 관주처리하는 입상수화제 2종의 제품을 개발하였다. 처리방법은 입제를 10a당 30㎏씩 밭 전체에 골고루 뿌린 다음 경운하고, 정식시에는 500배로 희석한 입상수화제에 묘를 침지하여 정식하고, 정식 후 10일 간격으로 입상수화제를 10a당 300g씩 3회 관주처리한 농가는 80%이상 방제되어 정상수확을 하였다. 실험에 참여한 농가와 제품을 생산할 산업체의 의견을 모아 입제는 60,000원(20㎏/200평용), 입상수화제는 20,000원(200g/200평용)로 가격을 정하였으며 이를 기준으로 0.5ha당 농가약제구입부담액은 900,000원이었으며, 농가별 병방제효과에 따라 차이는 있었지만 풋마름병방제에 의한 각 농가 평균소득증대에 대한 약제구입비 비중은 14%로 구입비부담이 적은 것으로 확인되었다.
10) 배추무름병 생물적방제실험
배추무름병원균에 길항력이 있는 Pseudomonas 5종과 Bacillus 2종을 동결건조하여 제형화하여 평난지와 고랭지에서 방제실험을 수행하였다. 평난지와 고랭지에서 발병율은 각각32.3%, 32.4%로 병피해가 심한 농가포장이었다. 평난지에서 무름병방제효과가 84.8%였던 P. auranthica는 고랭지에서 59.2%로 방제효과가 낮았는데 이는 평난지에 비해 고랭지 배추재배기간 중 잦은 비로 처리균의 밀도확보가 어려운것에 기인한 것으로 사료된다.
11) Freeze dry 방법을 통한 Pseudomonas putida 10301 세포안정화
Pseudomonas putida 10301 고열에 견딜 수 있는 열 안정성이 부족하여 순간이지만 고열을 거쳐야하는 spray dry 방법은 Pseudomonas sp. 에는 적당치 못하므로 경제적인 면에서 다소 비싸지만 동결건조 방법을 통해 세포의 안정화를 모색하였다. 발효가 종료된 배양액에서 세포를 분리한 후 여기에 10% 농도로 부형제를 한 후 -70℃에서 24hr 동안 예비 동결한 다음 freeze dry를 수행하고 40℃에서 저장 안정성 screening을 수행하였다.
다양한 polymer를 안정제로 첨가하여 cell의 저장성을 확보하는 실험을 수행한 결과 수용액 상태에서 점도가 너무 높아 적은 량을 녹일 수 있는 polymer와 불용성 그리고 합성 폴리머 등은 저장 안정성이 떨어졌다.
반면에 일반적으로 많이 사용하고 있는 소재들에서는 무처리에 비해 저장 안정성을 높게 나타내었는데 일반적으로 사용되는 에서 skim-milk 가장 좋은 저장 안정성 효과를 나타내었으며, 다음으로 soluble starch, levan 순이었다.
skim-milk와 비교해서 말토오즈(maltose)와 물엿(millet jelly)이 더 나은 저장 안정성을 나타냈다. 이상의 결과를 검토하여 보면, Pseudomonas putida 10301균을 동결건조 방법을 적용한 경우 적당한 부형제 및 안정제를 투입함으로써 제제 안정성을 일정기간 동안 확보할 수는 있지만 생산 비용이 증가하는 부담이 있었다.
12) Pseudomonas putida 10301 흡착(adsorption)을 이용한 세포안정화
배양원액 대 흡착제의 비율은 흡착제의 종류에 따라 다르지만 white carbon의 경우 1:1의 비율로 흡착할 정도로 흡착능이 좋다. 예비 실험 결과 흡착율은 좋지만 aging test에서 급격히 세포수가 감소하는 것으로 조사되었다. 따라서 여기에 동결건조시에 세포 보호 효과가 뛰어난 부형제인 물엿을 첨가하여 white carbon 에 흡착시켜 저장 기간별 세포수 감소 정도를 관찰하였으나, 마찬가지로 세포 안정화에 큰 영향을 미치지는 못하였다. 이상으로 동결건조 방법과 흡착을 통해 Pseudomonas 균의 저장 안정성을 높이는 제제화를 시도하였으나 Pseudomonas putida 10301균 세포의 특성상 단순한 제제 즉, 부형제의 첨가 등에 의한 방법으로는 제제의 한계를 나타내었다.
13) Bacillus licheniformis균주의 pilot plant scale에서 배양 최적화
Bacillus licheniformis균주를 5L배양조건을 기본으로하여 pilot plat scale(300L)에 배양최적화를 실시하였다. 배양조건은 30℃, pH 6.5로 조절하고 발효조 내의 용존산소(DO)는 aeration과 agitation을 이용하여 20%이상으로 유지하였다. 배양 중 발효조내 압력은 0.2bar로 유지하였다. 그 결과 Fig. 6과 같이 세포의 성장은 약 40 OD에 이르렀고 세포건조 중량은 L당 약 11g 정도가 생산 되었다.
14) Bacillus licheniformis원제의 제제 안정화
B. licheniformis포자는 열안정성이 있어 비용적인 측면을 고려하여 동결건조방법에 비해 Hot
spray dry 방식이 경제적으로 유리하였다. spore는 열에 어느 정도 안정하나 최적의 spray dry 조건과 활성을 유지시킬 수 있는 열 안정화 물질을 탐색하고자 다양한 당류와 polymer를 대상으로 한 결과 sun-cap은 변성 전분으로 기능성물질 등을 포접(encapsulation)하여 안정화시키는 능력이 우수하며, 냉수에 쉽게 용해되고 점도가 낮아 고농도의 용액 제조가 가능하여 분무공정에 적합한 물성을 갖추고 있다. 이와 같이 선정된 galactose와 sun-cap을 사용하여 pilot plant scale인 300L 발효조에서 배양한 Bacillus licheniformis를 VMF centrifuge로 harvest 하여 spray dry를 하였다.
15) S. griseus0104의 Dextrin을 이용한 500L 회분식 배양
보존중인 균주는 Benett's 고체배지에서 100mL/1000mL baffled flask 5개에 각각 단일 군락을 접종하여 30°C, 200rpm에서 20시간동안 배양한 1차 seed를 2L/5L baffled flask 5개에 각각 접종한 것을 2차 seed로 사용하였다. 조건은 1차 seed와 마찬가지로 30°C, 200rpm, 배양시간은 15시간으로 하였다. 이 2차 seed를 500L 발효조의 seed로 사용하였다. 500L 발효조의 초기 working volume은 300L였고 온도는 30°C, pH는 암모니아수 (28%)로 접종전에 7.0으로 보정한 후 배양 중 보정은 하지 않았다. 사용된 배지는 더 많은 시료확보를 위해 5L에서 사용한 dextrin을 3%에서 8%로 증가시켰고, 0.1% MgSO₄, 2% yeast extract, 0.5% soybean meal, 0.1% KH₂PO₄, 0.3% NaCl, 0.3% CaCO₃를 사용하였다. 배양이 진행되면서 pH가 떨어지기 시작하는 18시간 이후로 세포의 왕성한 성장을 보이고 있고 용존산소의 부족에 따라 점차적으로 rpm과 air량을 증가시킴으로써 최대 균체성장을 이끌 수 있었다. 20시간을 기점으로 pH가 증가하고 그와 함께 용존산소가 증가해야하지만 이미 많이 형성된 균사(mycelium)으로 인해 배양액 자체가 점성이 생기고 그로인해 DO (용존산소) membrane에 균사가 코팅 (coating)이 되어 제대로 sensor가 작동하지 않은 것으로 생각된다. 배양 후 45시간에 최대 O.D.값이 56.5이 나왔고 이 시간에 pH가 많이 올라간 것과 cell growth curve가 서서히 멈추는 것으로 이 시간의 시료를 채취하여 동결건조를 실시하여 그 세포수를 측정하였다. 45시간 배양 후의 발효액의 최종 volume은 300L였고 원심분리 후의 wet cell은 23.3kg, 동결건조시 2kg의 skimmilk를 첨가하였고 건조결과 8.3kg이 나왔다. 그 결과 배양액의 세포 수는 2.06×1⁷ CFU/g cell, 동결 건조 후 분쇄 후의 세포 수는 1.82×10⁷CFU/g cell을 보여 최종 배양액 대비하여 88.3%의 수율을 보이고 있다. 배양액을 원심분리 한 후의 전체 cell weight는 23.3kg이었고 5% skim milk가 함유된 동결건조 후의 dry cell weight은 8.3kg이었다.
16) 제품의 독성 및 병원성검증
본 시험은 S. grieus0104 고상 (10⁹ cfu/g)의 안전성 평가를 위하여 농촌진흥청고시 제2006-7호 (2006년 4월 17일) 및 EPA Guideline (OPPTS, adopted : 1996.2)에 의거하여 시험을 진행하였다. 시험항목은 인축독성시험 중 급성경구독성 및 병원성시험, 급성경피독성시험 및 병원성시험, 급성정맥 내 독성 및 병원성시험, 안점막자극성시험, 피부자극성시험, 피부감작성시험과 환경독성시험 중 잉어(Cyprinus carpio)영향시험 및 물벼룩(Daphnia magna)영향시험을 진행한 결과 인축독성시험인 급성경구독성 및 병원성시험, 급성정맥 내 독성 및 병원성시험, 피부자극성시험, 피부감작성시험에서 S. grieus0104의 투여농도로 투여한 결과 특이한 임상증상 및 병원성이 없는 것으로 판단하였다. 또한 안점막자극성시험 및 급성경피독성 및 병원성시험에서 S. grieus0104의 투여농도로 투여한 결과 약한 자극이 있었으나 투여 후 7일 이내 회복하였다. 또한 실험동물로 이용된 SPF랫드, 토끼(NZW) 및 Guinea pig의 체중변화는 대조군과 비교하여 유의차 없이 증가하여 S. grieus0104에 의한 장애영향은 없는 것으로 확인되었다.
17) 시제품생산 및 제품화를 위한 유효미생물 검정 및 오염미생물 검사
풋마름병 방제용 제품으로 2제품을 개발하였다. 토양 처리용 입제는 흙향(발효가 잘된 퇴비나 유기물이 풍부한 토양에서 나는 흙냄새는 토양에 있는 방선균이 생산하는 휘발성물질에 의한것임), 입상수화제는 청고탄(농가들이 사용하는 풋마름병을 잡는 다는 의미)로 상표등록을 추진하고 있다. 흙향과 청고탄생산에 필요한 재료들은 모두 농산부산물과 천연재료를 사용하여 동물이나 환경에 해를 끼치지 않는다. 두 제품의 품질은 미생물제등록에 필요한 분석의뢰인증기관인 목원대학교에서 품질검사을 받아 유효미생물인 S. griseus0104의 생균밀도를 확인하고 유해미생물에 대한 안전성도 확인받아 친환경농자재 목록공시등록에 필요한 제반서류를 제출하여 그 결과를 기다리고 있다.

Abstract ▼

Baterial wilt(Ralstonia solanacearum) and Soft-rot(Erwinia carotovora) damaged on tomato and oriental cabbage respectively is the most economically important soil-borne pathogens. The disease disperse fastly in high tempertaure and the infected plant wilted in short time to die.
Bacterial wilt of

Baterial wilt(Ralstonia solanacearum) and Soft-rot(Erwinia carotovora) damaged on tomato and oriental cabbage respectively is the most economically important soil-borne pathogens. The disease disperse fastly in high tempertaure and the infected plant wilted in short time to die.
Bacterial wilt of tomato spread through the soil. The bacterium enters tomato tissue through wounds in the root system or stems created by plant stress, other pathogen or horticultural practice. The entered bacteria invades the xylem and destroy the tissue and cause a sudden death of tomato. The disperse of bacteria is by furrow irrigation or surface water, cultivation, transplanting, wounding and pruning. Infested soil transported with seedlings or with farm implements, or infected seedlings are a source of long-distance dispersal of the bacterium. High temperatures (for example, 30-35 ) and high soil moisture favor disease development. ℃ Control of bacterial wilt is generally very difficult. Fumigation with chemicals like basamid is often used to control soil-borne diseases; however, it is highly toxic and not practical for obligate bacterial wilt control. Soil is the primary source of the disease and the bacterium survive in fumigated soil can invade the root. Both crop rotation to nonhosts and planting of resistant cultivars are useful methods to avoid the disease. Grafting susceptible tomato varieties onto the rootstock of resistant wild type lines is widely practiced in korea. The promising antagonist Streptomuces griseusBIG182-B1 grew on agar plate as linear mycelia and its spores oval, the results on morphological, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA sequence alignment revealed that S. griseus0104 belonged to Streptomyces griseusATCC25497. S. griseus0104 produced antibiotic metbolate in Medium 1 broth. The purified material selected after affinity column chromatogrphy (Amberite IRC-50) has antibacterilal activity on R.solanacearun. The infected root pieces that remain in the soil provide bacteria for infection of new tomato roots. The bacteria can survive in diseased tomato debris. The bacteria are released from the roots of the affected plant into the soil and can infect neighboring plants.
Biological control is one of the more promising approaches to reduce the disease incidence and yield losses caused by this disease. Based on antagonistic activity against R. solanacearum as well as biocontrol efficacy in the greenhouse, Streptomyces griseus0104 selected as potential biocontrol agents. In order to find a suitable antagonist inoculation method, we compaired the methods of root-dipping with soil-drenching in the aspects including rhizocompetence, biocontrol efficacy under greenhouse conditions. The drenching treatment resulted in a higher biocontrol efficacy, and this method was also easier to operate in the field on a large scale.
Field trials were conducted for further evaluation of this antagonist. In both greenhouse and field experiments, the isolate S. griseus0104 had good control effect against bacterial wilt. biocontrol efficacy of S. griseus0104 was about 80% in diseaed farmer's field trials. Three antagonisists cultured in pilot plant fermentation, and the cells harvested by centrifuge was dryed by freeze dry or spray dry according to temperature resistance. Pseudomonas Putida10301 and Bacillus licheniformis grew well in large scale fermenter and the cells were produced as powderd flouer. Two microbial pesticide named as "heughyang" and "cheungothan" did not harmful to animal and envioronment and biocontrol efficacy on bacterial wilt on tomato was very promising.. To assess the safety evaluation of S . grieus0104 formulae, Test was carried out in compliance with the Testing Guidelines for Safety Evaluation of Pesticides (Notification No. 2006-7 issued by Korea Rural Development Administration) and EPA Guidelines (OPPTS, adopted ; 1996.2). and there was no clinical signs and pathogenicity on Acute oral/Pathogenicity test, Acute intravenous toxicity/ Pathogennicity test, Acute dermal irritation test and Skin sensitization test.
Also there was mild irritation on Acute dermal/Pathogenicity test and Acute eye irritation test. Males and females of SPF Rat, Rabbit(NZW) and Guinea pig showed the same growth rate in body weight at the test period after the treatment.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 15
• 목차 ... 17
• 제 1장 연구개발 과제의 개요 ... 23
• 제 2장 국내외 기술개발현황 ... 24
• 제 3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 25
• 제 1절 토마토풋마름병 방제용 미생물제 병방제효과 ... 25
• 1. 토마토시설재배지 풋마름병 피해 및 방제현황 ... 25
• 가. 병피해상황 ... 25
• 나. 토마토풋마름병 진단 ... 26
• 다. 풋마름병 발생농가 방제현황 ... 28
• 2. 풋마름병 방제용 길항균 선발 ... 29
• 가. 토양내 미생물분리 ... 29
• 나. 분리균주 길항작용조사 ... 29
• 다. 길항균주 동정 ... 31
• 라. S. griseus0104의 토마토풋마름병원균에 대한 길항작용 ... 32
• (1) 배지조성별S. griseus0104 항균물질 생산 ... 32
• (2) 항균물질 분리정제 ... 34
• (3) S. griseus0104의 토양내 정착능 ... 36
• (4) S. griseus0104 처리에 의한 토마토풋마름병원균 밀도변화 ... 37
• (5) 풋마름병원균의 토양내 잔류양상조사 ... 37
• 3. S. griseus0104제품생산을 위한 제형기술개발 ... 38
• 가. 대량배양을 위한 액체배양배지 선발 ... 39
• 나. 고체배양 ... 40
• (1) 배양배지선발 ... 40
• (2) 균체수확 및 원제생산 ... 41
• (3) 토양혼화처리용 입제생산 ... 43
• (4) 관수처리용 입상수화제 생산 ... 44
• 4. 토마토풋마름병 피해농가 현지포장시험 ... 44
• 가. S. griseus0104 균체처리에 의한 방제효과조사 ... 44
• (1). 시험농가 포장선정 및 포장관리 ... 44
• (2) 정식 및S. griseus0104 균체처리 ... 44
• (3) 풋마름병방제효과 ... 45
• 나 제형물 . 풋마름병방제효과 극대화를 위한 기내시험 ... 48
• (1) S. griseus0104 제형물 처리에 의한 토양내 풋마름병원균 방제효과조사 ... 48
• (2) 제형별 S. griseus0104 밀도조정에 의한 풋마름병방제 증진효과조사 ... 49
• 다 토마토풋마름병방제용 . 기능성퇴비제조 및 병방제효과조사 ... 50
• (1) 발효퇴비 제조 ... 50
• (2) 토마토풋마름병방제용 기능성퇴비 살포효과 ... 51
• (가) 발효촉진을 위한 농산부산물첨가효과 ... 51
• (나) 부산물첨가 발효퇴비S. griseus0104 균체처리효과 ... 51
• (다) 퇴비 입제첨가효과 ... 53
• 라. 토마토풋마름병방제를 위한 토양살포용 입제, 관수용 입상수화제 체계처리효과 ... 54
• 라. S. griseus0104 미생물제 처리효과에 의한 경제성분석 ... 55
• 마. 양액재배(코코피트)농가 입상수화제 처리효과 ... 56
• 바. 피해농가 현지 방제시험 ... 57
• 제 5절 배추무름병방제용 길항균주 ... 61
• 1. 길항균주선발 ... 61
• 2. 균체시료제조 ... 61
• 가. 배양배지 선발 및 배양조건 ... 61
• 나. 균체 안정화를 위한 수확과정 ... 62
• 3. 병방제실험 ... 63
• 가. 평난지 고온기 배추무름병 생물적방제실험 ... 63
• 나. 고랭지배추 무름병 생물적방제실험 ... 64
• 제2절 길항미생물 제품화생산을 위한 대량생산 공정확립 ... 66
• 1. Pseudomonas putida 10301의 대량배양 및 제제화 ... 66
• 가. Pseudomonas putida 10301의 소용량 발효조(5ℓ) 배양 최적화 연구 ... 66
• (1) 분석내용 ... 66
• (가) 당농도의 분석 ... 66
• (나) 균체농도 측정 ... 66
• (다) 생균수 측정 ... 67
• (라) 플라스크 최적배양조건 ... 67
• (마) 소용량 발효조(5L) 에서의 최적화 연구 ... 67
• (바) siderophore 생성량 측정 ... 67
• (2) 결과 및 고찰 ... 68
• (가) 플라스크 배양을 통한 배양 최적화 ... 68
• 나. Pseudomonas putida 10301의 300ℓ 발효조 배양최적화연구 ... 74
• (1) 재료 및 방법 ... 74
• (가) 공시균주 및 보존 ... 74
• (나) 균체농도 측정 ... 74
• (다) 포도당농도 측정 ... 75
• (라) 300ℓ 발효조에서의 배양 최적화연구 ... 75
• (2) 결과 및 고찰 ... 75
• 다. Pseudomonas putida 10301균의 제제 안정화 ... 76
• (1) 재료 및 방법 ... 76
• (가) 냉동동결건조(freeze dry) ... 77
• (나) 경시 안정성 검사 ... 77
• (2) 결과 및 고찰 ... 77
• (가) Freeze dry 방법을 통한 세포안정화 ... 77
• (나) 흡착(adsorption)을 이용한 세포안정화 ... 79
• 2. Bacillus licheniformis의 대량배양 및 제제화 ... 80
• 가. 재료 및 방법 ... 81
• (1) 공시균주 및 보존 ... 81
• (2) 사용배지 ... 82
• 나. 배양 최적화 실험 ... 82
• (1) Bacillus licheniformis균주의 5L jar fermentor에서의 배양 최적화 ... 82
• (2) Bacillus licheniformis균주의 pilot plant fermentor에서의 배양 최적화 ... 82
• 다. 분석방법 ... 82
• (1) 균체량 및 포자농도 측정 ... 82
• (2) 포도당 농도 측정 ... 83
• 4. 미생물 원제의 안정적 수확기술개발 ... 83
• (1) Bacillus licheniformis spore 수확 ... 83
• (가) spray dry ... 83
• (나) freeze dry ... 84
• (다) 경시변화 ... 84
• 마. 결과 및 고찰 ... 84
• (1) Bacillus licheniformis균주의 5L jar fermentor에서의 배양 최적화 ... 84
• (2) Bacillus licheniformis균주의 pilot plant scale에서 배양 최적화 ... 86
• (3) Bacillus licheniformis원제의 제제 안정화 ... 87
• 3. Sreptomyces griseus0104의 Pilot 배양을 위한 배양조건 실험 ... 89
• 가. 실험재료 ... 89
• (1) 고체배지 ... 89
• (2) 액체배지 ... 89
• 나. 실험 방법 ... 89
• (1) 균주 보관 ... 89
• (2) 고체 배양 ... 89
• (3) 종균 배양 ... 90
• (4) 본배양 ... 90
• (5) 세포수 측정 ... 90
• 다. 연구수행결과 ... 90
• (1) 고체배지선별 ... 90
• (2) 플라스크 배양을 통한 액체배지선별 ... 92
• (3) 5L 발효조의 회분식 배양 ... 94
• ① Bennett's 배지와 YM 배지의 5L 회분식 배양 ... 94
• ② Dextrin을 이용한 5L 회분식 배양 (1) ... 95
• ③ Dextrin을 이용한 5L 회분식 배양 (2) ... 98
• 라. 연구 성과 및 향후 개발 ... 99
• 4. S. griseus0104 pilot배양에 의한 균체 대량생산 및 안정화 ... 101
• 가. 연구수행 내용 및 결과 ... 101
• (1) 실험재료 ... 101
• (나) 사용 배지 ... 101
• ① 고체배지 ... 101
• ② 액체배지 ... 101
• 나. 실험방법 ... 102
• (1) 균주보관 ... 102
• (2) 고체배양 ... 102
• (3) 종균배양 ... 102
• (4) 본배양 ... 102
• (5) 세포수 측정 ... 102
• (6) 분석 방법 ... 103
• 다. 연구수행결과 ... 103
• (1) 고체배지선별 ... 103
• (2) 플라스크 배양을 통한 액체배지선별 ... 103
• (3) 5L 발효조의 회분식 배양 ... 111
• (4) Dextrin을 이용한 500L 회분식 배양 ... 115
• 라. 연구 성과 및 향후 계획 ... 119
• 제3절. 토양병해방제용 미생물 원제 및 제품에 대한 안전성조사 ... 120
• 1. 길항균주 5종에 대한 안전성조사 ... 120
• 가. 시험목적 ... 120
• 나. 미생물농약등록을 위한 조사지침자료 ... 120
• 다. 원제독성조사 길항균주 ... 120
• 라. 원제독성 예비시험 ... 121
• 마. 연구내용 ... 121
• (1) 공시시험동물 ... 121
• (2) 순화 및 검역 ... 121
• (3) 사육환경 ... 122
• (4) 투여약량 수준설정 및 시험물질조제 ... 122
• (5) 시험물질투여 ... 124
• (6) 관찰 및 조사항목 ... 124
• 바. 결과 및 고찰 ... 125
• (1) 치사동물 및 LD50값 ... 125
• (2) 일반중독증상 ... 125
• (3) 체중변화 ... 125
• (4) 부검소견 ... 126
• 2. 토양병해방제용 미생물 원제(S. griseus0104)에 대한 독성 및 병원성검증 ... 127
• 가. 시험목적 ... 127
• 나. 연구수행지침자료 ... 127
• 다. 연구내용 ... 127
• ◦ S. griseus0104 원제의 병원성검증 재료 ... 127
• ◦ 공시 시험동물 ... 127
• ③ 순화 및 검역 ... 128
• ④사육환경 ... 128
• ⑤ 투여약량 수준설정 및 시험물질 조제 ... 129
• ⑥ 시험물질의 투여 ... 130
• ⑦ 관찰 및 조사항목 ... 130
• ⑧ 반수치사용량(LD50) 및 반수치사농도(LC50) 산출 ... 132
• 4. 연구결과 고찰 ... 132
• ① 급성경구 및 병원성시험 ... 132
• ②급성정맥 및 병원성시험 ... 134
• ③ 급성경피 및 병원성시험 ... 135
• ④담수어류에 대한 영향시험 ... 135
• ⑤ 담수무척추동물에 대한 영향시험 ... 136
• 5. 고 찰 ... 136
• 3. 제품의 안전성 평가(흙향, 청고탄 제품의 독성 및 병원성 검증) ... 138
• 가. 요약 ... 138
• 나. S. grieus0104고상 (109 cfu/g)의 급성경구독성 및 병원성시험 ... 138
• 다. S. grieus0104 고상 (109 cfu/g)의 급성경피독성 및 병원성시험 ... 139
• 라. S. grieus0104 고상 (109 cfu/g)의 급성정맥 내 독성 및 병원성시험 ... 140
• 마. S. grieus0104 고상 (109 cfu/g)의 안점막자극성시험 ... 141
• 바. S. griseus0104 고상 (109 cfu/g)의 피부자극성시험 ... 142
• 사. S. grieus0104 고상(109 cfu/g)의 피부감작성시험 ... 143
• 아. S. grieus0104 고상 (109 cfu/g)의 잉어(Cyprinus carpio) 영향시험 ... 145
• 자. S. grieus0104 고상 (109 cfu/g)의 물벼룩(Daphnia magna) 영향시험 ... 146
• 제 4절 토마토풋마름병 방제용 미생물제 흙향, 청고탄 생산 ... 149
• 가. 제조기술 확립 ... 149
• 나. 품질관리시스템 구축 ... 150
• 다. 풋마름병방제 시제품의 유효미생물 검정 및 오염미생물 검사 ... 152
• 라. 풋마름병방제 시제품의 생물농약 등록 ... 161
• 제 4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 162
• 제 5장 연구개발성과 및 성과활용계획 ... 168
• 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 168
• 제 7장 참고문헌 ... 169
• 끝페이지 ... 174