초록 ▼

○ 연구결과
버섯 균사체 종균보존 방법과 종균 배양 조건 확립하고, 종균의 대량 배양 체제 및 알코올생산에 최적 환경을 구축하여 신 기능성주류개발을 성공하였다. 종균이 생산하는 항암, 면역증강 효과를 가진 물질을 분석 하였으며. 세포수준에서 생리활성 효과를 검정할 수 있었다.
그리고 신 기능성 주류의 유효물질에 대한 실험 모델적용 및 간질환 모델에 적용하여 그 효과를 확인할 수 있었고 주류의 제품화를 위한 성분분석 및 관능검사를 실시하여 현재는 신기능성 주류의 대량생산에 성공하여 산업화되어 주당 42만병이 생산되고 있다.

○ 연구결과
버섯 균사체 종균보존 방법과 종균 배양 조건 확립하고, 종균의 대량 배양 체제 및 알코올생산에 최적 환경을 구축하여 신 기능성주류개발을 성공하였다. 종균이 생산하는 항암, 면역증강 효과를 가진 물질을 분석 하였으며. 세포수준에서 생리활성 효과를 검정할 수 있었다.
그리고 신 기능성 주류의 유효물질에 대한 실험 모델적용 및 간질환 모델에 적용하여 그 효과를 확인할 수 있었고 주류의 제품화를 위한 성분분석 및 관능검사를 실시하여 현재는 신기능성 주류의 대량생산에 성공하여 산업화되어 주당 42만병이 생산되고 있다. 특히 본 과제의 결과로 만들어진 “천년약속 프라임”은 2005년 APEC 공식 건배주로 지정되었다.

Abstract ▼

1. Mycelial Culture, Alcohol Production and Making Alcohol Beverage
1-1. Mycelial Culture and Optimization for Alcohol Production
The strain was maintained on agar slant or petridish at 4℃. Subculture was done once in every month. Alternatively, liquid culture was prepared to be stored at -8 0

1. Mycelial Culture, Alcohol Production and Making Alcohol Beverage
1-1. Mycelial Culture and Optimization for Alcohol Production
The strain was maintained on agar slant or petridish at 4℃. Subculture was done once in every month. Alternatively, liquid culture was prepared to be stored at -8 0℃ and in liquid nitrogen. Yield of growth and alcohol production were better from mycelia of subculture in every month than from ones of other storage stocks. A new technique should be developed because subculture in every month has limit for long-term store and large-scale culture. Culture was done with basal medium containing different nitrogen sources: the composition of basal medium was 2% glucose, 0.17% KH2PO4, 0.05% MgSO4.7H20. Basal medium with either malt extract or yeast extract showed better growth than other nitrogen sources.
Optimal condition was determined for best alcohol production, which is confidential to the company. Under this condition mycelia produced 8% alcohol while yeast did less than 4%. This results reflect that the condition is better for mycelia than yeast.
Alcohol dehydrogenase was purified from mycelia and its molecular mass was approximately 46,000 dalton and substrate specificity of the enzyme was higher to ethanol by oxidation reaction and to acetaldehyde by reduction reaction. Optimal pH and temperature for activity was pH8 and 25℃~ 35℃, respectively.
Alcohol fermentation by mycelia, instead of yeast, was done with rice and rice koji under the optimal condition following traditional fermentation technique. 12.3% alcohol was produced by 11 days of fermentation indicating that mycelial fermentation can be applied to alcohol beverage production.
1-2. Development of Alcoholic Beverage containing Pharmaceutical Compounds
It has been reported that alcoholic beverage made by Pl-21 mycelium showed fibrinolytic and anti-thrombin activities. We, therefore, investigated W8 and W130 which showed higher fibrinolytic and anti-thrombin activities. However, W8 and W130 did not ferment alcohol. We tried mixed-culture of Pl-21 with W8 or W130
in order to increase fibrinolytic and anti-thrombin activities in fermented product. Anti-thrombin activity was increased by Pl-21 and W8 while Pl-21 and W130 did not. Pl-21 and W8 also showed better alcohol production, flavor and taste than Pl-21 alone.
1-3. Making commercial product of functional alcoholic beverage
Fermentation condition was determined for 3 ton scale with water, rice, koji, Nuruk, mycelia to produce large-scale alcoholic beverage. 3 ton scale condition was modified for 13 ton scale. Alcoholic beverage produced in this way became commercial products named "Millenium Promise (14%, 375ml)", "Millenium Promise Prime (12%, 500ml)" and "LINTEUS (16%, 700ml)". Specially, "Millenium Promise Prime" was the official toast wine of 2005 APEC.
2. Food and Nutritional Analysis of Product and Making commercial product to meet Costumer's Trends
2-1. Analysis of Pharmaceutical Compounds in Alcohol Product
Isolated glycoprotein was acidic polysaccharide of MW 200,000, which was analysed by chromatography. Glycoprotein composed with 72.2% polysaccharide and 22.3% protein. Polysaccharides contained mannose (41.6%), galactose (23.4%), and glucose (23.8%) and proteins contained mainly aspartic acid (9.0%), serine(11.8%), glutamic acid (11.1%), glycine (12.0%), alanine (12.7%).
Volatile flavor compounds of 3 different Pellinus mushrooms were identified to be 65 volatile flavor compounds: 7 alcoholic, 15 aldehyde, 12 ketone, 8 ester, 10 hydrocarbon, 3 furan, 3 phenol, 2 acid, and 5 unidentified compounds. Common compounds found in 3 different Pellinus mushrooms were ethyl acetate, hexanol, benzaldehyde, 1-octen-3-ol, 2-pentyl furan, (E)-2-octenal and octanol. 1-octen-3-ol, E-2-octenal and benzaldehyde of them have been known to be present in other edible mushrooms.
2-2. Food and Nutritional Analysis of Alcohol Product
Sugars, organic acids and alcoholic compounds were analyzed in order to understand food and nutritional aspects of alcohol beverage made by Pl-21. Sugar analysis showed high composition of glucose and sucrose. Concentration of acetaldehyde was low and methyl alcohol was not detected in alcoholic compounds.
Organic acids are close related with taste of alcohol beverage and those were analyzed by HPLC technique. Organic acids in alcohol beverage were identified by retention time of standard organic acids using C18 Column (4.6 x 250mm, 5㎛). 5 organic acids (oxalic acid, formic acid, malonic acid, lactic acid, succinic acid) were detected and relative concentrations of formic acid and lactic acid were higher than others.
2-3. Analysis of Pharmaceutical Compounds in Alcohol Product
Clear zone on the spot where mycelial alcohol product was placed occurred on fibrin plates while no clear zone by distilled alcohol. Also, when distilled alcohol or mycelial alcohol product was mixed with fibrin mycelial alcohol product delayed formation of fibrin. This results indicated that mycelial alcohol product has fibrinolytic and fibrin formation inhibition activities.
After administration of distilled alcohol or mycelial alcohol product to rats GOT and GPT level in blood were lower in rats administered with mycelial alcohol product than in rats administered with distilled alcohol. Specially GPT, which present in liver only, decreased, indicating that liver damage could be less. Histochemical study showed similar results. Therefore, mycelial alcohol product appeared not to give damage to liver inflammation. Additionally, increase of total cholesterol and triacylglycerol concentration was lower in rats administered with mycelial alcohol product.
2-4. Analysis of Flavor in Alcohol Product
Flavor is close related with customer's trends. Thus, volatile flavor of mycelial alcohol product, Millenium Promise, was analyzed using GC and GC-MS. The amount of volatile flavor in the extract was 12.5mg% and obvious flavor of honey, beer, and wine was smelled. Major flavor compounds identified were followed: 15 alcohol group such as 3-methyl butanol, phenylethyl alcohol, 6 acidic group such as acetic acid, 12 ester group (1.60%) such as ethyl acetate, diethyl butanedioate, 4 hydrocarbon group (0.32%) such as propyl benzene, 3 ketone group (0.28%) such as δ-decalactone, phenol group and other minor groups (3.57%).
3. Effects of medicinal materials of rice wine on the physiological activity and alcoholic disease model.
3-1. Effect of the evaporating extract from rice wine of fermentation using mycelium of P. linteus (SHJ) on the expression of inflammatory proteins and the generation of reactive oxygen species
The SHJ inhibited acetaldehyde-induced morphological change in HepG2 cells. Also, SHJ inhibits expression of inflammatory proteins including COX-1 and COX-2 through suppressing nuclear translocation of NF-κBp65 and degradation of IκBα. In addition, SHJ inhibits generation of ROS by H2O2 in HepG2 cells. These results suggest that SHJ has the pharmaceutical, especially anti-inflammatory, activity
similar to P. linteus mushroom.
3-2. Effects of fermented rice wine by using mycelium of P. linteus (SHJ) on the expression of inflammation-related proteins in human hepatoma cells and rat liver
To examine the effect of SHJ on the morphology and expression of inflammatory proteins in HepG2 cells, the cells were incubated with ethanol, and SHJ for 24 hours, and then analyzed by microscopic observation and Western blot and RT-PCR. While ethanol induced the morphological change accompanied with cell debris formation and scattering on HepG2 cells, SHJ had no effect. The results of Western blot and RT-PCR analyses showed that the level of iNOS, COX-1 and COX-2 was induced by ethanol, however, SHJ inhibited the expression of these proteins and its mRNAs. In the animal model, the value of GOT and GPT was significantly increased by administration with ethanol. But the group administrated with SHJ showed lower levels on the changes of these markers compared with ethanol-administrated group. Besides, the results of Western blot and RT-PCR analyses showed that the expression of inflammatory proteins such as iNOS, COX-1 and COX-2 was not affected by SHJ administration in rat liver. About histopathological and immunohistochemical observations, inflammatory loci were markedly decreased in the SHJ-administrated rat compared to ethanol-administrated rats and showed weaker COX-2 and iNOS immunoreactions. These results suggested that SHJ showed slight changes on the inflammatory protein expression compared to ethanol and SHJ may be used as a functional alcoholic beverage.
3-3. Effects of fermented rice wine using mycelium of P. linteus on the gastric mucosa of rat
The administration of SHJ showed a similar pattern as like normal except trace histopathological changes. The results of Western blot analyses showed that the higher expression of iNOS, COX-1, COX-2, TNF-α and c-fos, especially COX-2, in the ethanol-administrated rat compared with normal rat. But SHJ-administrated rat showed a trace increase of these expression compared to normal rat. About immunohistochemical observations, weaker iNOS reactions were detected in mucous cells of epithelium of ethanol administrated rat compared with normal and SHJ-administrated rat. These results suggested that SHJ-administrated rat showed a trace changes on the mucus barrier-related protein expression compared with ethanol-administrated rat and thus SHJ may be use to develop a functional alcoholic beverage.
3-4. Effects of mycelial culture of P. linteus (MCPL) on ethanol-induced gastric ulcer in rats
Pre-administration with MCPL at doses of 20 and 60 ㎎/㎏ showed a significant decrease of bleeding and ulcer index and alleviated the histopathological changes induced by ethanol such as hemorrhage and necrosis. Ethanol treatment decreased gastric adhesion mucus content, but higher level of gastric mucus persisted by pre-administration of MCPL. As for histochemical properties of mucins, marked changes were observed in both surface and gland mucous cells in ethanol treated rats, but these changes were detected only in surface mucous cells in rat pre-administrated with MCPL. By conventional methods for mucins, ethanol-treated rats revealed a decrease of neutral and acid mucin in the surface epithelium and mucous neck cells compared with normal rats. A marked decrease of BSL-1 by lectin histochemistry was also revealed in the ethanol-treated rats. But the MCPL pre-administrated rat showed similar stainabilities and lectin affinities patterns for mucins as normal ones. These results indicate that pretreatment of MCPL provided a protection of gastric mucosa from ethanol-induced injury through maintaining mucus barrier in rats.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 10
• CONTENTS ... 19
• 목차 ... 24
• 제1장. 연구 개발 과제의 개요 ... 28
• 제1절. 연구 개발의 목적과 범위 ... 28
• 1. 연구개발의 필요성 ... 28
• 2. 경제·산업적 측면 ... 29
• 3. 사회·문화적 측면 ... 30
• 제2장. 국내외 관련기술의 현황과 문제점 ... 32
• 제1절. 국내 관련기술의 현황과 문제점 ... 32
• 제2절. 국외 관련기술의 현황과 문제점 ... 32
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 33
• 제1절 연구 개발방법 ... 33
• 1. 알코올 농도의 측정 ... 33
• 2. Alcohol dehydrogenase의 활성 측정 ... 33
• 3. 효소의 정제 ... 33
• 4. 버섯 균사체에 의한 약주 발효 ... 34
• 5. 다당체추출법 ... 34
• 6. 이온교환수지와 겔거르기 크로마토그래피를 이용한 이온 다당체의 분리 ... 34
• 7. 단백질량과 아미노산조성측정 ... 35
• 8. 당분석 ... 35
• 9. FT-IR과 NMR분석 ... 35
• 10. 3 종류의 상황버섯의 향기성분(휘발성 성분)을 분석방법 ... 35
• 11. 혈전용해 활성측정과 항 혈전활성측정 ... 36
• 12. 휘발성 향기성분 농축물 제조 ... 36
• 13. 휘발성 향기성분의 분석 및 동정 ... 37
• 14. 향과 맛을 소비자 기호에 맞추어 조성비를 확립 ... 37
• 15. 세포주를 이용한 상황버섯균사체 발효주 및 그 추출물의 기능성 검정 ... 42
• 15-1. 상황버섯균사체 발효주 및 추출물 분리 ... 42
• 15-2. 세포주의 배양 및 처리 ... 42
• 15-3. 광학현미경적 관찰 ... 42
• 15-4. Nitric oxide (NO) 농도 측정 ... 42
• 15-5. Reactive oxygen species (ROS) 검출을 위한 형광염색 ... 42
• 15-6. Nuclear extract의 분리 ... 42
• 15-7. SDS-PAGE 및 Western blotting ... 43
• 15-8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석 ... 43
• 15-9. 단백질 밴드의 optical density 측정 ... 43
• 16. 실험동물을 이용한 상황버섯 균사체 발효주 및 그 추출물의 기능성 검정 ... 43
• 16-1. 실험동물 ... 43
• 16-2. 알코올 또는 상황버섯균사체 발효주 투여 ... 43
• 16-3. 혈액채취 및 혈장 catecholamine측정 ... 44
• 16-4. Alcohol 유발 위궤양 및 측정 ... 44
• 16-5. 위벽의 점액 측정 ... 44
• 16-6. 조직병리학적 검색 ... 44
• 16-7. 면역조직화학적 검색 ... 44
• 16-8. 복합당질에 대한 고전적 조직화학 ... 44
• 16-9. 복합당질에 대한 lectin조직화학 ... 45
• 16-10. 통계처리 ... 45
• 제2절, 연구 개발 결과 ... 46
• Ⅰ. 버섯 균사체 종균배양 및 알코올 생산 최적화 ... 46
• 1. 종균보존 시스템의 확립 ... 46
• 2. 종균의 액체배양 ... 46
• 3. 종균으로부터 알코올 생산을 위한 최적 조건 확립 ... 47
• 4. 종균 유래의 alcohol dehydrogenase 의 확인과 특성 ... 50
• 5. 종균으로부터 amylase의 분비 확인 ... 51
• 6. 주류 생산을 위한 기초적 실험의 확립 ... 52
• Ⅱ. 약리성분함유 신 기능성 주류개발 ... 53
• 1. 종균의 대량생산 배지의 개발과 대량 배양 체제의 구축 ... 53
• 1-1. 배양에 따른 균사체 생산량 비교 ... 53
• 1-2. 종균배양을 위한 배지조성 ... 53
• 1-3. 배지조성별 배양전 균사체의 알코올 생산능력비교 ... 54
• 2. Koji제조시 종균 선택을 위한 검정 ... 55
• 2-1. Koji제조 종균 Asp. Kawachii와 Asp.oryzae사용시 술덧의 pH변화와 제조 종균 Asp.Kawachii와 Asp.oryzae사용시 술덧 발효과정중 품온의 변화 ... 55
• 2-2. Koji종균 Asp.Kawachii와 Asp.oryzae를 썼을 경우 알코올생산의 비교 ... 56
• 3. 약리물질 함량을 증가하기 위한 대책확립 ... 56
• 3-1. 버섯균사체 혼합배양에 의한 혈액순환개선효과의 비교 ... 56
• 3-2. 버섯균사체 혼합배양에 의한 알코올 생산력 비교 ... 57
• 4. 증자ㆍ무증자 쌀의 발효에 의한 주류생산 효율성 비교 ... 58
• 4-1. 2단, 3단 사입을 무증자 쌀로 발효할 경우 알코올의 생산 ... 58
• 4-2. 증자 쌀과 무증자 쌀 사입에 의한 알코올 생산 ... 58
• 5. 주류발효를 위한 최적 환경의 구축 ... 59
• 5-1. 균사체(Pl-21)배양을 위하여 배지조성에 따른 알코올 생산과 품온의 변화 ... 59
• 6. 소규모 발효를 통한 최적 주류 생산 환경의 구축 ... 60
• 6-1. 물 10ℓ와 40ℓ배양 중 품온의 변화 ... 60
• 6-2. 물 10ℓ와 40ℓ배양에 의한 알코올(Ethylalcohol)의 생산 ... 60
• Ⅲ. 신기능성 주류의 대량생산과 제품화 ... 61
• 1. 주류의 대량생산 체제에 대비한 발효환경조건의 설정확립 ... 61
• 1-1. 균사체의 대량생산 ... 61
• 1-2. 주류 대량생산시 발효 탱크의 환경변화와 alcohol생산 ... 63
• 2. 대량 주류 발효시 초기 종균 생육조건 확립 ... 69
• 2-1. 3ton 발효탱크의 균사체 종균 접종비율 ... 69
• 2-2. 13ton 발효탱크의 균사체 종균 접종 비율 ... 70
• 3. 버섯 추출물 첨가에 따른 발효 중 문제점 해결 ... 70
• 4. 공장 수준의 시설에서 신 기능성 주류의 대량생산 시범운행 ... 70
• 5. 신 기능성 주류 제품을 위한 시제품의 생산 ... 72
• Ⅳ. 종균이 생산하는 약리성분 물질의 분석 ... 73
• 1. 크로마토그래피를 이용한 단백다당체의 분리 ... 74
• 2. 단백다당체의 조성분석 ... 74
• 3. FT-IR분석 ... 75
• 4. 향기분석 ... 77
• Ⅴ. 제품의 영양?식품학적분석 및 약리성분의 증대 방안 확립 ... 80
• 1. 생산된 주류에 대한 영양ㆍ식품학적 분석 ... 80
• 2. 생산된 주류에 함유된 약리물질 분석 ... 81
• 2-1. 혈전용해기능 ... 81
• 2-2. GOT · GPT의 영향 ... 82
• 2-3. 간조직에 미치는 영향 ... 83
• 2-4. 혈중 총 콜레스테롤과 총 지질저하 효과 ... 83
• 3. 주류에 약리성분을 증가하기 위한 식품학적 대책 ... 84
• 4. 향과 맛을 개발하기 위한 식품학적 대책구축 ... 84
• 4-1. 신맛을 위한 대책 ... 84
• 4-2. 레진 사용을 통한 acetic acid의 제거 ... 85
• 4-3. 향의 개선을 위한 대책 ... 85
• 5. 생산 주류 고유 향의 분석 ... 86
• 5-1. Ester류 ... 86
• 5-2. Alcohol류 ... 86
• 5-3. Acid류 및 hydrocarbon류 ... 87
• 5-4. Lactone류 ... 87
• 6. 제품의 소비자 선호도를 높이기 위한 대책의 확립 ... 89
• Ⅵ. 고 선호도 주류 제품의 완성 ... 90
• 1. 주류 제품화를 위한 단백질, 유리아미노산, 지질당, 미량원소등의 성분 분석을 위한 제품 규정에 맞게 기준을 확립 ... 90
• 1-1. 개발 주류의 단백질 측정 ... 90
• 1-2. 개발 주류의 유기산 분석 ... 90
• 2. 향과 맛을 소비자 기호에 맞추어 조성비를 확립 ... 95
• 2-1. 일반사항 ... 95
• 2-2. 술을 처음으로 마시게 된 경위 ... 95
• 2-3. 술을 처음으로 마신 시기 ... 96
• 2-4. 술을 평가할 때 가장 중요하게 생각하는 것 ... 96
• 3. 주세법 규정에 맞춘 제품 허가 기준에 준한 검정완료 ... 103
• Ⅶ. 주류 함유 약리 물질의 생리활성 및 알코올성 질환 모델에 대한 효과 검정 ... 104
• 1. 상황버섯균사체 발효주의 추출물이 염증관련 단백질 및 세포내 활성산소에 미치는 영향 ... 104
• 1-1. 상황버섯균사체 발효주의 추출물이 알코올 분해에 미치는 영향 ... 104
• 1-2. 상황버섯균사체 발효주의 추출물이 항산화 작용에 미치는 영향 ... 105
• 2. HepG2 세포에서 상황버섯균사체 발효주의 염증관련 인자에 미치는 영향 ... 107
• 3. 상황버섯균사체 발효주의 투여에 의한 흰쥐의 혈장분석 및 간내 염증관련 인자 분석 ... 110
• 3-1. 혈청학적 분석 ... 110
• 3-2. 염증관련 단백질의 발현 ... 113
• 4. 상황버섯균사체 발효주의 투여가 흰쥐의 간 손상에 미치는 영향 ... 114
• 4-1. 간에 대한 조직병리학적 관찰 ... 114
• 4-2. Glycogen 분포에 대한 조직화학적 관찰 ... 115
• 4-3. 염증관련 단백질에 대한 면역조직화학적 관찰 ... 116
• 5. 상황버섯균사체 발효주 투여가 위 점막 손상에 미치는 영향 ... 117
• 5-1. 위점막의 병리조직학적 관찰 ... 117
• 5-2. 상황버섯균사체 발효주의 투여에 따른 위 조직의 염증 관련 단백질의 변화 ... 118
• 6. 상황버섯 균사체 추출물 (MCPL)이 알코올성 스트레스 및 위궤양에 미치는 영향 ... 120
• 6-1. 스트레스성 호르몬에 미치는 영향 ... 120
• 6-2. Alcohol성 위궤양에 미치는 영향 ... 122
• 제4장 목표달성도 ... 128
• 제1절 목표달성도 ... 128
• 참고문헌 ... 131
• 끝페이지 ... 137