초록 ▼

IV. 연구개발결과 및 활용에 대한 건의
가. Nanofiltration을 이용한 저감미 유당분해우유의 개발
유당분해효소로 우유의 유당을 분해한 후 nanofiltration으로 1.6의 농축율로 농축한 후 가수하여 제조한 나노여과유당분해우유는 우유가 원유와 유사한 감미를 가지고 있었으며 칼슘과 인이 각각 칼슘과 인이 각각 97.5mg%과 92.9mg%로 시판되고 있는 한외여과유당분해우유의 78.1mg%과 69.8mg% 보다 높았다. 이 연구에서 개발된 나노여과유당분해우유는 시판되고 있는 한외여과유당분해우유 보다 칼슘과

IV. 연구개발결과 및 활용에 대한 건의
가. Nanofiltration을 이용한 저감미 유당분해우유의 개발
유당분해효소로 우유의 유당을 분해한 후 nanofiltration으로 1.6의 농축율로 농축한 후 가수하여 제조한 나노여과유당분해우유는 우유가 원유와 유사한 감미를 가지고 있었으며 칼슘과 인이 각각 칼슘과 인이 각각 97.5mg%과 92.9mg%로 시판되고 있는 한외여과유당분해우유의 78.1mg%과 69.8mg% 보다 높았다. 이 연구에서 개발된 나노여과유당분해우유는 시판되고 있는 한외여과유당분해우유 보다 칼슘과 인의 손실이 적은 우수한 방법이다.
나. Nanofiltration을 이용하여 제조된 저감미 유당분해우유를 공급한 흰쥐의 체내 칼슘 이용성
유당 분해우유가 탈지우유에 비해 변을 통한 칼슘의 배설량은 높게 나타났으나 혈청의 칼슘, 인, 크레아티닌 농도와 ALP 활성, 간과 신장의 무게와 칼슘 함량, 뼈의 무게, 길이에도 차이가 없는 것으로 나타났다. 단위 몸무게(100g)당 뼈의 무게는 유당분해우유 공급군이 유의하게 높게 나타났으나(p<0.05), 회분의 양은 탈지우유군이 높게 나타났다(p<0.05). 그러나 회분의 양과 뼈의 강도가 반드시 일치하지는 않는다는 보고들이 있으므로 이 결과는 크게 칼슘의 이용성에 주요한 의미를 부여한다고는 볼 수 없다. 이와 같은 결과는 nanofiltration 막여과법을 이용하여 농축한 후 포도당과 갈락토스의 비율을 적절히 조절하여 개발된 유당분해우유가 영양적으로 생체에 미치는 영향이 탈지우유군에 비해 떨어지지 않고 유당불내증을 예방할 수 있는 유익한 식품으로의 사용가능성을 보여주고 있다.
다. Pantoea sp. B-1에서 분리한 β-galactosidase의 생화학적 특성 및 우유 내유당분해 활성
Pantoea sp. B-1의 세포 추출물에 비해 순수분리된 β-galactosidase는 28.5배 효소활성도가 높았으며 ONPG 가수분해 활력은 30℃에서 156.8㎛ol/minㆍmg이었다. β-galactosidase의 반응 최적 온도는 45℃이고 최적 pH는 5.5∼7.5이었다. β-galactosidase의 열안정성을 조사한 결과 45℃이상의 온도에서 불활성화 되는 것으로 나타났다. 다른 β-galactosidase와의 우유 내 유당분해능력을 비교한 결과 Pantoea spp. B-1에서 분리된 β-galactosidase는 대장균의 효소보다 활력이 높았으나 Kluyveromyces lactis 효소(Validase)보다는 상대적으로 낮았다.
라. Candida kefyr Y-3에서 분리한 호냉성 β-galactosidase의 생화학적 특성 Candida kefyr의 세포추출물에 비해 정제된 β-galactosidase는 1,200배 효소활성도가 높았으며 회수율은 20%이었다. 정제된 β-galactosidase의 최적 pH는 pH 7.5였고, 최적 온도는 35℃였다. 열 안정성은 20℃와 25℃에서의 활성은 120분이 경과한 후에도 감소하지 않고 유지되었으나, 30℃에서는 점점 감소하였고 40℃와 45℃에서는 10분 이후에 활성이 모두 감소하여 거의 나타나지 않았다.
마. 호냉성 유당분해효소생산균주의 분리 및 선발
유당 분해능력이 매우 우수하다고 판단되는 균주를 우유시료에서는 MB26-4, MC14-3, 네팔 히말라야의 HB20-4와 HB27-1를 알라스카 북극지역에서는 B1-2, F5-1, F10-5, N12-5, 남극시료에서는 S7-1, S14-2를 최종 10종을 선발하였다. 선발된 10종의 균주를 형태학적, 이화학적특성, 지방산의 조성 및 16S rDNA sequencing의 결과에 의해 MB26-4는 Hafnia alvei, MC14-3는 Hafnia alvei, HB20-4는 Arthrobacter psychrophilus, HB27-1는 Hafnia alvei, B1-2는 Serratia grimesii,, F5-1 Hafnia alvei,, F10-5 Hafnia alvei, N12-5 Rhanella aquaticus, S7-1은 Pseudoalteromonas sp. , S14-2는 Hafnia alvei, 로 각각 동정되었다. 분리한 10종의 적정 pH, 적정온도, 온도 안정성등을 조사하였다.
바. 호냉성 유당분해효소의 유전자 분리 및 유전자 구조
MC14-3(A1), MC14-3(A3), N12-5, MB26-4에서 β-galactosidase유전자를 분 리하였으며, 분리한 유전자들을 각각 MC14-3(A1)β-gal, MC14-3(A3)β-gal, N12-5β-gal 라고 명명하고 염기서열을 결정하였다. MB26-4에서 유전자 부분 단편이 분리 되었으며 MC14-3(A1)β-gal 과 동일하였다. MC14-3(A1)β-gal은 888 염기로 유전자의 N 말단 부위의 부분 유전자가 분리되었으며 cloning에 사용된pRSET C 의 종결 코돈을 포함하는 109bp의 단편이 C 말단 부위를 구성하고 있다. MC14-3(A3)β-gal 은 918 염기쌍으로 구성되어 있었다. MC14-3(A1)β-gal β
-galactosidase의 최적온도는 37℃ 최적 pH는 6.8이며, MC14-3(A3)β-gal β
-galactosidase의 최적온도는 37℃, 최적 pH는 7.2이다.
사. 호냉성 유당분해 효소의 생산체계 확립 및 재조합 유당분해효소의 우유의 유당분해
β-Galactosidase 유전자, MC14-3(A1)β-gal 을 PCR에 의해 복제한 후 YT&A에 삽입한 후 HindⅢ 로 분해하여 MC14-3(A1)β-ga을 pRSET C 에 삽입하였다.
pRSET C를 EcoRⅠ으로 분해하여 MA14-3(A1)β-gal 을 포함하는 DNA 단편을 pPICZα C 에 삽입하여 Pichia pastoris 에 전이하는데 사용하였다.
Lac-MA14-3(A1)가 삽입된 pPICZα C이 Pichia pastoris X-33의 chromosomalDNA에 integration 된 경우 Pichia pastoris X-33의 chromosomal DNA 의 3"AOX1 primer와 5‘AOX1 primer를 사용하여 PCR로 확인하였다. MC14-3(A1)β-gal이 전이된 Pichia pastoris X-33을 BMMY broth에서 20℃혹은 30℃에서 발현을 시도 했으나 발현되지 않았다. 재조합 유당분해효소를 이용하여 우유의 유당을 분해하였다.
아. 활용에 대한 건의
본 연구개발의 결과는 원유로부터 저감미 유당분해우유를 생산하기 위한 새로운 공정으로 사용될 수 있다. 핀랜드에서 개발하여 특허등록이 된 한외여과법에 비해 본 연구에 특허출원한 nanofiltration 방법이 차이점과 우수성이 인정이 되어 등록이 되면 산업적으로 응용할 수 있다.
본 연구에서 개발한 Pantoea의 β-galactosidase는 시판되는 Klyveromyces lactis의 β-galactosidase보다 내열성이 강하여 유당분해우유를 제조하기 위하여 사용하기 보다는 발효유롤 제조에 사용하는 것이 바람직하다. 반면에 Candida kefyr에서 분리한 β-galactosidase는 열안정성이 낮아 냉장온도에서 활력이 높은 효소로 밝혀져 실용화를 위한 연구가 필요하다.
M14-3(A1)β-gal 과 M14-3(A3)β-gal 의 β-galactosidase가 실용성이 있을 것으로 판단되며 이의 실용화를 추진할 것이다. 실용화하기 위해서는 고정화가 필요하며, 원유에 존재하는 미생물 및 미생물이 분비하는 단백질 분해효소에 의한 영향이 검토 되어야 할 것이다.

Abstract ▼

II. Results and Conclusion
1. Development of lactose-hydrolyzed milk with low sweetness by using nanofiltration
lactose-hydrolyzed milk was concentrated 1.6 times by using nanaofiltration membrane and reconstituted to original volume by adding water. The reconstituted lactose-hydrolyzed milk h

II. Results and Conclusion
1. Development of lactose-hydrolyzed milk with low sweetness by using nanofiltration
lactose-hydrolyzed milk was concentrated 1.6 times by using nanaofiltration membrane and reconstituted to original volume by adding water. The reconstituted lactose-hydrolyzed milk had similar sweetness as milk. The contents of calcium, phosphorus, and vitamin ₂ in the reconstituted lactose-hydrolyzed milk were 96%, 91%, and 80% of those of milk, respectively. However The contents of calcium, phosphorus, and vitamin ₂ in commercial reconstitute lactose-hydrolyzed milk were 92%, 81%, and 80% of those of milk. The reconstituted lactose-hydrolyzed milk was proved to be nutrjtionally better than the commercial reconstituted lactose-hydrolyzed milk.
2. In vivo Utilization by white rat of Calcium in Lactose-Hydrolyzed Milk is concentrated by using Nanofiltration
Twenty of Sprague-Dawley male rats with the weight of 180g each were divided into two groups. Milk powder and lactose hydrolyzed milk powder were provided as the source of protein and calcium. Mineral mixture adjusted to the AIN-93 was provided in the feed for six weeks. Calcium utilization was measured by metabolic experiment. There was no difference between the experimental groups in diet intake, body weight and FER. There was no difference between the experimental groups in the contents of calcium, phosphorus and creatinin in serum, and the ALP activity. There was no difference in the contents of calcium of liver and kidney. There was no difference between the experimental groups in the weight and length of the bone and its calcium content. However, the weight of bone per unit of body weight(100g) was significantly high in the group that lactose hydrolyzed milk was provided(p<0.05) and the content of ash of the bone was significantly high in the group provided with milk powder (p<0.05). The blood glucose was not significantly different, however it increased gradually in the group provided with lactose hydrolyzed milk powder during experimental period. The excretion of calcium in feces was significantly high in the group that lactose hydrolyzed milk powder was provided(p<0.05), and there was no difference between the experimental groups in calcium intake, urinary calcium excretion, calcium absorption, calcium retention. These results showed that the lactose-hydrolyzed milk powder is no less nutritionally effective on the body than milk powder.
3. Biochemical Characteristics and Lactose Hydrolysis Activity in Milk of Psychrotrophic β-Galactosidase from Pantoea sp. B-1
The specific enzyme activity of the purifed β-galactosidase was 28.5 times higher than that of cell-free extract of Pantoea sp. B-1 isolated from humus soil. The specific ONPG-hydrolyzing activity at 30℃ of the purified enzyme was 156.8㎛ol/min·mg. The optimum temperature and pH for the enzyme activity was 45℃and 5.5∼7.5, respectively. The enzyme activity was inactiviated at the temperature above 45℃. The lactose-hydrolyzing activity of the purified β-galactosidase in the milk was higher than that from Excherichia coli and lower than Validase from Kluyveromyces lactis.
4. The purification and characterization of β-galactosidase from Candida kefyr Y-3
The specific enzyme activity of the purifed β-galactosidase was 1,200 times higher than that of cell-free extract of Candida kefyr isolated from milk. The specific ONPG-hydrolyzing activity at 30℃ of the purified enzyme was 113.6㎛ol/min·mg. The optimum temperature and pH for the enzyme activity was 35℃and 7.5, respectively. The enzyme activity was stable at 20℃ and inactiviated above 30℃.
5. Isolation and selection of β-galactosidase-producing psychrophilic bacteria
Ten strains of β-Galactosidase-producing psychrophilic bacteria was isolated from farm milk in Korea, Himalaya Nepal, Northern region of Alaska, and antiarctic area. There were identified six strains of Hafnia alvei, Arthrobacter psychrophilus, Serratia grimesii, Rhanella aquaticus, Pseudoalteromonas sp. Their optimum temperature and pH and heat stability was determined.
6. Isolation and characterization of psychrophilic β-galactosidase gene
The β-galactosidase gene was isolated from the bacterial strains of MC14-3(A1), MC14-3(A3), N12-5 and MB26-4. The isolated genes were named MC14-3(A1)β-gal, MC14-3(A3)β-gal, and N12-5β-gal and their DNA sequences were determined. The gene isolated from MB26-4 was identical with MC14-3(A1)β-gal. The gene of MC14-3(A1)β-gal consisted of 888 bp containing N-terminal region of the β-galactosidase gene and 109 bp containing C-terminal region of pRSET C including terminal codon. MC14-3(A3)β-gal contains 918 bp. The optimum tempeature and pH of β-galactosidase of MC14-3(A1)β-gal were 37℃ and 6.8, respectively. The optimum temperature and pH of β-galactosidase of MC14-3(A3)β-gal β-galactosidase were 37℃ and 7.2, respectively.
7. Production of recombinant β-galactosidase and lactose hydrolysisL
The gene of MC14-3(A1)β-gal was synthesized by PCR and inserted into YT&A vector. The inserted vector was digested with HindⅢ and MC14-3(A1)β-ga was inserted into pRSET C. The pRSET C vector was digested with EcoRⅠ and the resultant DNA fragment containing MA14-3(A1)β-gal was inserted into pPICZα C. The vector was used to transform Pichia pastoris. pPICZα C containing Lac-MA14-3(A1) was integrated into chromosomal DNA of Pichia pastoris X-33. The integrated Pichia pastoris X-33 which was determined to containing the gene using PCR didnot produce the enzyme in BMMY broth at 20℃ and 30℃. The characteristics of lactose hydrolysis by recombinant β-galactosidase was determined.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 15
• 목차 ... 16
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 18
• 제2장 Nanofiltration을 이용한 저감미 유당분해 우유의 개발 ... 19
• 제1절 서론 ... 19
• 제2절 재료 및 방법 ... 21
• 제3절 결과 및 고찰 ... 22
• 제4절 요약 ... 26
• 제5절 참고문헌 ... 27
• 제3장 Nanofiltration을 이용하여 제조된 저감미 유당분해우유를 공급한 흰쥐의 체내 칼슘 이용성 ... 28
• 제1절 서론 ... 28
• 제2절 재료 및 방법 ... 29
• 제3절 결과 및 고찰 ... 32
• 제4절 요약 ... 35
• 제5절 참고문헌 ... 35
• 제4장 Pantoea sp. B1에서 분리한 호냉성 β-galactosidase의 생화학적 특성 및 우유 내 유당분해 활성 ... 38
• 제1절 서론 ... 38
• 제2절 재료 및 방법 ... 39
• 제3절 결과 및 고찰 ... 42
• 제4절 요약 ... 54
• 제5절 참고문헌 ... 54
• 제5장 우유에서 분리한 Candida kefyr Y-3에서 정제한 β-galactosidase의 생화학적 특성 ... 57
• 제1절 서론 ... 57
• 제2절 재료 및 방법 ... 58
• 제3절 결과 및 고찰 ... 61
• 제4절 요약 ... 67
• 제5절 참고문헌 ... 68
• 제6장 호냉성 유당분해효소생산균주의 분리 및 선발 ... 70
• 제1절 서론 ... 70
• 제2절 재료 및 방법 ... 71
• 제3절 결과 및 고찰 ... 76
• 제4절 요약 ... 170
• 제7장 호냉성 유당분해효소의 유전자 분리 및 유전자 구조 ... 171
• 제1절 서론 ... 171
• 제2절 재료 및 방법 ... 171
• 제3절 결과 및 고찰 ... 175
• 제4절 요약 ... 186
• 제8장 호냉성 유당분해효소의 생산체계 확립 ... 187
• 제1절 서론 ... 187
• 제2절 재료 및 방법 ... 187
• 제3절 결과 및 고찰 ... 189
• 제 4 편 요 약 ... 193
• 제9장 재조합 유당분해효소에 의한 우유 유당 분해 ... 194
• 제 1 편 서 론 ... 194
• 제 2 편 재료 및 방법 ... 194
• 제 3 편 결과 및 고찰 ... 195
• 제4절 참고문헌 ... 196
• 제10장 목표 달성도 및 연구개발결과의 활용계획 ... 199
• 제 1 편 목표 달성도 ... 199
• 제2절 관련분야에의 기여 및 활용계획 ... 200
• 끝페이지 ... 201