초록 ▼

○ 연구결과
알코올성 간질환 예방 및 치료용 식용생물자원 함유 phytochemicals의 소재화를 최종 목적으로 수행한 연구개발 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 식용생물자원 200 여종을 용매의 극성에 따라 계통추출한 후 각각의 획분에 대하여 간섬유화 억제활성, 산화적 손상에 대한 간세포 보호활성, 알코올 유도 CYP2E1 조절활성, 알코올성 지방간 억제활성(협동과제)을 in vitro assay계로 1, 2차 검색한 결과 각각 녹차, 녹차, 보리, 도라지가 선정되었다.
(2) 녹차로부터 추출한 간섬유화 억제

○ 연구결과
알코올성 간질환 예방 및 치료용 식용생물자원 함유 phytochemicals의 소재화를 최종 목적으로 수행한 연구개발 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 식용생물자원 200 여종을 용매의 극성에 따라 계통추출한 후 각각의 획분에 대하여 간섬유화 억제활성, 산화적 손상에 대한 간세포 보호활성, 알코올 유도 CYP2E1 조절활성, 알코올성 지방간 억제활성(협동과제)을 in vitro assay계로 1, 2차 검색한 결과 각각 녹차, 녹차, 보리, 도라지가 선정되었다.
(2) 녹차로부터 추출한 간섬유화 억제활성물질은 HSC-T6 cell을 사용한 in vitro 실험과 Wister albino rat을 사용한 in vivo 실험에서 각각 높은 억제활성과 무독성을 나타내었으며, 분리한 물질을 구조해석한 결과 EGCG로 판명되었고 타 녹차 카테킨류들도 억제활성이 있음을 확인하였다.
(3) 녹차로부터 추출한 산화적 손상에 대한 간세포 보호활성물질은 HepG2/2E1 cell 및 ICR mouse를 사용한 in vivo 실험에서 각각 높은 보호활성과 무독성을 나타내었으며, 분리한 물질을 구조해석한 결과 ECG로 판명되었고 타 녹차 카테킨류들도 보호활성이 있음을 확인하였다.
(4) 보리로부터 추출한 알코올 유도 CYP2E1 저해활성물질은 E. coli 의 membrane fraction 및 ICR mouse를 사용한 in vivo 실험에서 각각 높은 저해활성과 독성실험에서도 무독성을 나타내었으며, 분리 물질을 구조해석한 결과 procyanidin B₃로 판명되었다.
(5) 도라지로부터 추출한 알코올성 지방간 억제활성물질은 HepG2 2E1LNCX cell 및 Sprague-Dawley rat을 사용한 in vivo 실험에서 각각 높은 억제활성과 무독성을 나타내었으며, 분리한 물질을 구조해석한 결과 분자량 418의 phthalic acid-diisononylester 또는 hydroxyl alkyl ester 물질로 추정되었다.

Abstract ▼

Ⅱ. Results and Application of the project
Approximately 160 kinds of edible plants were serially extracted according to solvent solubility. Each fraction was screened for the liver fibrosis inhibitory activity, liver cell protective activity against oxidative stress, alcohol-induced CYP2E1 regula

Ⅱ. Results and Application of the project
Approximately 160 kinds of edible plants were serially extracted according to solvent solubility. Each fraction was screened for the liver fibrosis inhibitory activity, liver cell protective activity against oxidative stress, alcohol-induced CYP2E1 regulatory activity, and alcoholic fatty liver inhibitory activity (cooperative project), and the selected samples were green tea(Camellia sinensis), green tea(Camellia sinensis), barley(Hordeum vulgare var. hexastichon), and Doragi(Platycodon grandiflorum), respectively. The summary of the results and application of present study are as follows:
Sub-project 1 : The inhibitory component of liver fibrosis extracted from green tea exhibited high inhibitory activity in vitro experiment using HSC-T6 cell, as well as in vivo experiment using Wistar albino rats. In addition, this component revealed no toxic symptoms. The component was identified as EGCG by structure analysis, and other green tea catechins were also revealed inhibitory activity in liver fibrosis.
Sub-project 2 : The liver protective component against the oxidative stress extracted from green tea exhibited high protective activity in vitro experiment using HepG2/2E1 cell line, as well as in vivo experiment using ICR mouse. In addition, this component revealed no toxic symptoms. The component was identified as ECG by structure analysis, and other green tea catechins were also revealed protective activity in alcoholic liver damage.
Sub-project 3 : The alcohol-induced CYP2E1 activity regulatory component extracted from barley revealed high regulatory activity in vitro experiment using membrane fraction of E. coli, as well as in vivo experiment using ICR mouse. In addition, this component revealed no toxic symptoms, and the IC₅₀ of the isolated component was very low.
Cooperative projective 4 : The inhibitory component of alcoholic fatty liver extracted from Doragi(Platycodon grandiflorum)showed high inhibitory activity in vitro experiment using HepG2/2E1 cell line, as well as in vivo experiment using Sprague-Dawley rats. In addition, this component revealed no toxic symptoms. The component was speculated as phthalic acid- diisononylester or hydroxyl alkyl ester substance with molecular weight of 418 by structure analysis.
Physiologically bio-active phytochemicals from natural edible plants were screened, isolated, characterized and materialized for neutraceuticals.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 9
• 목차 ... 15
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 20
• 제1절 연구개발과제의 목적과 범위 ... 20
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 21
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 25
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
• 제1절 알코올성 간섬유화 억제활성 phytochemicals의 소재화 ... 26
• 1. 서설 ... 26
• 2. 재료 및 방법 ... 28
• 가. 재료 및 시약 ... 28
• 나. 실험 방법 ... 28
• 1) 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 검색 시료 조제 ... 28
• 2) 알코올성 간섬유화 억제활성 in vitro assay계 ... 29
• 3) 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 in vivo 안전성 실험 ... 30
• 4) 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 in vivo 유효성 assay계 ... 30
• 5) 녹차로부터 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 추출 및 분획 ... 33
• 6) 녹차로부터 간섬유화 억제활성물질의 분리 및 정제 ... 34
• 7) 녹차 함유 간섬유화 억제활성물질의 구조 분석 ... 34
• 3. 결과 및 고찰 ... 34
• 가. 식용식물소재로부터 알코올성 간섬유화 억제활성물질 검색 ... 34
• 1) 알코올성 간섬유화 억제활성물질 1차 검색 ... 34
• 2) 알코올성 간섬유화 억제활성 시료의 2차 검색 ... 34
• 3) 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 in vivo 안전성 실험 ... 44
• 4) In vivo에서의 알코올성 간섬유화 억제활성 ... 45
• 나. 녹차 함유 알코올성 간섬유화 억제활성물질의 정제 ... 50
• 1) 녹차의 methanol 추출 및 유기용매 분획 ... 50
• 2) 1차 silical-gel column chromatograpy ... 51
• 3) 2차 silical-gel column chromatograpy ... 51
• 4) Prep-Thin layer chromatography ... 53
• 5) HPLC ... 54
• 다. 정제물질의 구조해석 ... 54
• 라. 녹차로부터 분리된 EGCG의 collagen type I 억제활성 ... 57
• 마. 시판 카테킨류의 collagen type I 억제활성 ... 58
• 제2절 알코올의 산화적 손상에 대한 간세포 보호활성 phyochemicals의 소재화 ... 59
• 1. 서설 ... 59
• 2. 재료 및 실험 방법 ... 60
• 가. 재료 및 시약 ... 60
• 나. 실험 방법 ... 61
• 1) 알코올성 간세포 보호활성물질 검색용 시료의 조제 ... 61
• 2) 간세포 보호활성 in vitro assay계 ... 62
• 3) 알코올에 의한 간세포 보호활성물질의 in vivo 독성실험 ... 63
• 4) In vivo에서의 시료에 의한 cytochrome P450 2E1 저해활성 측정 ... 63
• 5) 선정시료 녹차의 methanol 추출 및 유기용매 분획 ... 64
• 6) 녹차로부터 알코올에 의한 간손상 보호물질의 분리 및 정제 ... 66
• 7) 녹차 함유 알코올성 간손상 보호물질의 구조분석 ... 66
• 3. 결과 및 고찰 ... 66
• 가. 식용생물자원으로부터 알코올 간손상 보호물질의 검색 및 시료의 선정 ... 66
• 1) 식용생물자원으로부터 알코올성 간손상 보호물질의 1차 검색 ... 66
• 2) 선정시료 녹차의 in vivo 독성 실험 ... 66
• 3) 선정된 간세포 보호활성물질의 in vivo 유효성 실험 ... 67
• 나. 선정된 간세포 보호 활성 물질의 정제 ... 80
• 1) 녹차에서 간세포 보호활성물질의 탐색을 위한 1차 물질 분리 ... 80
• 2) 1, 2차 Silical-gel 60 column chromatography에 의한 녹차 methanol 추출물질의 분리 ... 81
• 3) HPLC에 의한 활성물질 분리 ... 81
• 다. 정제물질의 구조분석 및 동정 ... 81
• 라. 녹차로부터 분리된 epicatechin gallate(ECg)의 간세포 보호활성 ... 81
• 마. 녹차 카테킨류들의 in vitro 간세포 보호활성 ... 82
• 제3절 알코올 유도 CYP2E1 활성조절 phytochemicals의 소재화 ... 89
• 1. 서설 ... 89
• 2. 재료 및 실험 방법 ... 90
• 가. 재료 및 시약 ... 90
• 나. 실험 방법 ... 90
• 1) CYP2E1 저해활성물질 검색용 시료의 조제 ... 90
• 2) CYP2E1 저해활성활성 in vitro assay계 ... 92
• 3) CYP2E1 저해활성물질의 In vivo 독성 실험 ... 92
• 4) CYP2E1 저해활성물질의 in vivo 유효성 실험 ... 93
• 5) 선정 시료 보리의 메탄올 추출 및 유기용매 분획 ... 94
• 6) 보리로부터 CYP2E1 활성억제물질의 분리 및 정제 ... 95
• 7) 정제물질의 구조분석 및 동정 ... 97
• 3. 결과 및 고찰 ... 97
• 가. 식용식물로부터 CYP2E1 저해활성물질 검색 ... 97
• 1) 식용식물로부터 CYP2E1 저해활성물질의 1차, 2차 검색 ... 97
• 2) 선정된 보리 methanol 추출물의 in vivo 독성 검토 ... 97
• 3) In vivo에서의 CYP2E1 저해활성 ... 97
• 나. 보리 함유 CYP2E1 저해활성물질의 정제 ... 110
• 1) 보리의 methanol 추출 및 유기용매 분획 ... 110
• 2) 보리로부터 CYP2E1 저해활성물질의 분리 및 정제 ... 111
• 다. 정제물질의 구조해석 ... 112
• 제 4 절 알코올성 지방간 억제활성 phytochemicals의 소재화 ... 116
• 1. 서설 ... 116
• 2. 재료 및 실험 방법 ... 118
• 가. 재료 및 시약 ... 118
• 나. 실험 방법 ... 118
• 1) 알코올성 지방간 억제활성물질 검색 시료의 조제 ... 118
• 2) 알코올성 지방간 억제활성 in vitro assay계 ... 120
• 3) 알코올성 지방간 억제활성물질의 in vivo 안전성 실험 ... 120
• 4) In vivo에서의 알코올성 지방간 억제활성 측정 ... 122
• 5) 선정시료 도라지 methanol 추출 및 유기용매 분획 ... 125
• 6) 도라지로부터 알코올성 지방간 억제활성물질의 분리 및 정제 ... 127
• 7) 도라지 함유 알코올성 지방간 억제활성물질의 구조 분석 ... 127
• 3. 결과 및 고찰 ... 127
• 가. 식용식물로부터의 알코올성 지방간 억제활성물질의 검색 ... 127
• 1) 식용식물로부터 알코올성 지방간 억제활성물질의 1차 검색 ... 127
• 2) 알코올성 지방간 억제활성 시료의 2차 검색 ... 127
• 3) 알코올성 지방간 억제활성물질의 in vivo 안전성 ... 137
• 4) In vivo에서의 알코올성 지방간 억제활성 ... 138
• 나. 도라지 함유 알코올성 지방간 억제활성물질의 정제 ... 146
• 1) 도라지의 methanol 추출 및 유기 용매 분획 ... 146
• 2) 1차 silica gel 60 open column chromatography ... 147
• 3) 2차 silica gel 60 open column chromatography ... 147
• 4) Prep-Thin layer chromatography ... 148
• 5) HPLC ... 149
• 다. 정제 물질의 구조 해석 ... 151
• 제5절 알코올성 간질환용 phytochemicals의 소재화 ... 154
• 1. 서설 ... 154
• 2. 활성 phytochemicals의 추출조건 최적화 및 공업적 수준의 정제방법 확립 ... 155
• 가. 녹차(Camellia sinensis)로부터 간섬유화 억제물질의 bench-scale 수준적 추출방법 ... 155
• 나. 녹차(Camellia sinensis)로부터 간세포 보호활성 성분의 bench-scale 수준적 추출방법 ... 157
• 다. 보리(Horedeum vulgare)로부터 CYP2E1 저해활성 성분의 bench-scale 수준적 추출방법 ... 160
• 라. 도라지(Platycodon grandiflorum)로부터 알코올성 지방간 억제활성물질의 bench-scale 수준적 추출방법 ... 162
• 3. 활성 phytochemicals의 bench-scale 수준적 부분정제방법 확립 ... 165
• 가. 녹차(Camellia sinensis)로부터 간섬유화 억제물질의 bench-scale 수준적 부분정제방법 ... 165
• 1) 녹차 methanol 추출물의 유기용매 분회 ... 165
• 2) Methanol 분획물의 탈색 ... 165
• 3) Ultrafiltration ... 166
• 4) Diaion HP-20 open column chromatography ... 166
• 나. 녹차(Camellia sinensis)로부터 간세포 보호활성 성분의 bench-scale 수준적 정제방법 ... 169
• 1) Methanol 추출물의 hexane 및 chloroform ... 169
• 2) Methanol 분획물의 탈색 ... 169
• 3) Ultrafiltration ... 170
• 4) Diaion HP-20 open column chromatography ... 170
• 다. 보리(Horedeum vulgare)로부터 CYP2E1 저해활성 성분의 bench-scale 수준적 정제방법 ... 173
• 1) 보리 methanol 추출물의 유기용매 분획 ... 173
• 2) Methanol 분획물의 탈색 ... 173
• 3) Diaion HP-20 column chromatography ... 174
• 라. 도라지(Platycodon grandiflorum)로부터 알코올성 지방간 억제활성물질의 bench-scale 수준적 정제 방법 ... 177
• 1) Methanol 추출물의 hexane 및 acetone 분획 ... 177
• 2) Methanol 분획물의 탈색 ... 177
• 3) Silica gel 60 open column chromatography ... 178
• 제6절 알코올성 간질환용 phytochemicals의 기능성식품화 ... 181
• 1. 재료 및 방법 ... 181
• 가. 드링크제 제작 ... 181
• 나. 연질캡슐 제작 ... 181
• 다. 과립제 제작 ... 181
• 2. 결과 ... 181
• 가. 드링크제제 ... 181
• 나. 연질캅셀 제제 ... 183
• 다. 과립제 제작 ... 184
• 라. 제품의 외관, 미생물 검사 ... 185
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 187
• 제1절 연구개발 목표달성도 ... 187
• 제2절 관련분야에의 기여도 ... 191
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 192
• 제1절 추가 연구의 필요 ... 192
• 제2절 타 연구에의 응용 ... 192
• 제3절 기업화 추진 방안 ... 192
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 193
• 1. Acetaldehyde에 의한 collagen type I 생성 측정 ... 193
• 2. DMN에 의한 흰쥐에서의 간섬유화 유발 ... 193
• 3. Human CYP2E1의 간세포에서의 발현과 활성측정 ... 193
• 4. Human CYP2E1의 대장균에서의 발현과 활성측정 ... 193
• 5. Mouse에서 알코올 유도 CYP2E1의 발현과 microsome에서의 활성측정 ... 194
• 6. 간세포의 cytosol부분에서의 L-FABP의 측정 ... 194
• 7. 알코올 유도 지방간의 생성 및 해석방법 ... 194
• 제7장 참고문헌 ... 195
• 부록 Ⅰ. 학회발표 및 논문 발표 ... 200
• 부록 Ⅱ. 특허출원 ... 219
• 끝페이지 ... 223