초록 ▼

○ 연구결과
1) strip 제작에 필요한 효소의 생산 - shaking culture상에서 배양하고 접종하는 방식 성공 단가를 절감
2) 최적 스트립 membrane의 선택 - immoblon-P가 테스트한 여러 membrane중 효소의 접착성, membrane의 변형방지성, 지지대와의 고정성들 모두에서 뛰어남
3)효소의 정제법 확립-가장적절한 스트립용효소는 정제법 개발
4) 효소의 성공적 고정 - 최적 고정제의 발굴 및 배합비율 확인
5)부롬수 대체 용액개발 - 인체에 치명적인 부롬수를 대처할 수 있는

○ 연구결과
1) strip 제작에 필요한 효소의 생산 - shaking culture상에서 배양하고 접종하는 방식 성공 단가를 절감
2) 최적 스트립 membrane의 선택 - immoblon-P가 테스트한 여러 membrane중 효소의 접착성, membrane의 변형방지성, 지지대와의 고정성들 모두에서 뛰어남
3)효소의 정제법 확립-가장적절한 스트립용효소는 정제법 개발
4) 효소의 성공적 고정 - 최적 고정제의 발굴 및 배합비율 확인
5)부롬수 대체 용액개발 - 인체에 치명적인 부롬수를 대처할 수 있는 용액(BS)를 개발하여 적용하여 부롬수와 같은 효과를 내 대쳐가능함을 입증
6)발색법의 개량 및 규격화 - 기존의 ellman 법의 단점을 보완하는 발색법을 개발하여 발색방법을 규격화하였다.
7)strip 제작 및 잔류농약 검정 - 시중 농약에 대해 잔류량 검정을 실시한 결과 대만에서 수입되는 효소를 이용한 습식 방법보다 우수함이 입증
8)strip을 이용한 검정방법의 규격화 - 새로운 strip에 맞는 간편하고 반복성이 뛰어나고 손쉬운 실험법을 규격화하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Result and application
1) Mass production of AChE for strip- Routine culture of insect cells (sf9 and Hi-5 cells) and infection of baculovirus in T-flask culture take a long time and high cost because of disposable flask. We successfully change this to shaking culture system which give more pr

Ⅳ. Result and application
1) Mass production of AChE for strip- Routine culture of insect cells (sf9 and Hi-5 cells) and infection of baculovirus in T-flask culture take a long time and high cost because of disposable flask. We successfully change this to shaking culture system which give more production and can use the reusable culture bottle. As a result the total cost of production of enzyme cut down to 1/10.
2) Proper choice of membrane for strip-immoblon-P turned out the best membrane for the strip in terms of adhesiveness, in deformity, reactivity to fixing reagents.
3) Design the purification method-Purity and cost are always in the counter proportion. To reach the maximum efficiency, we have to find the point which satisfy the purity for strip and cost. Finally we find that the ammonium sulfate precipitation and dialysis is enough for strip.
4) Enzyme Fixation-Mixing with enzyme with X1213 (crossing agent) 1 to 2 ratio used to fix the AChE to the membrane and it give no alteration of activity after fixing and give long stability.
5) Replacement solution for Br.-Br is used to reduce the organophosphate but it is very detrimental to health. We find BS as a replacement for Br. It showed same reducing power with Br and no side effect.
6) Design manual for color development-In Ellman method, The color developed fast but the color is not stable. We modified the Karnovasky method to develope the red color which give the stable color.
7) Manufacture the strip and test the residual insecticide- We manufacture the test strip containing 7mm diameter round biosensor attached strip and test the ability to detect 22 kind different insecticides and compared to that of conventional method (TARI method). Newly developed strip resulted more sensitive against 90% of tested insecticides and the rest are same.
8) Design the manual for strip-New manual is designed for reproducibility, conveniency, and on-spot usage.
For the successful application, technically, following research to develop more sensitive AChE against few organophosphates is desirable. In industrial aspect, we better have the instrument to manufacture the strip automatically. And potable reader for the strip color is helpful to determine the accurate % of inhibition.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 5
• CONTENTS ... 8
• 목 차 ... 11
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 14
• 1. 기술적 측면 ... 14
• 2. 경제산업적 측면 ... 15
• 3. 사회 문화적 측면 ... 16
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제 1 절 국내.외 관련기술의 현황과 문제점 ... 17
• 1. 국외 기술 현황 ... 17
• 2. 국외 수입기술의 문제점 ... 17
• 3. 국내 기술개발 현황 ... 18
• 4. 본 연구팀의 선행연구 내용 및 수준 ... 19
• 제 2 절 앞으로의 전망 ... 19
• 제 3 장 연구 개발 수행 내용 ... 21
• 제 1 절 연구개발 목표와 내용 ... 21
• 제 2 절 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 22
• 제 3 절 연구개발 방법 및 설계 ... 24
• 1. 최적 acetylcholinesterase의 분리법 탐색 ... 24
• 2. Baculovirus 기술 적용 ... 24
• 3. 효소의 안정성 연구 ... 24
• 4. 최적 strip membrane선별 ... 25
• 5. 브롬수(Br) 대체 기술 ... 25
• 6. 육안 판정용 발색시약 개발 ... 26
• 7. 발색시약 최적 조건 ... 26
• 8. 발색시약의 첨가 방법 간편화 기초 실험 ... 27
• 제 4 절 연구개발 추진 체계 ... 27
• 제 4 장 연구결과 ... 28
• 제 1절 strip 제작에 필요한 효소 정제 및 최적 strip 선발 ... 28
• 1. 최적 acetylcholinesterase의 분리법 탐색 ... 28
• 2. Baculovirus 기술 적용 ... 31
• 3. 효소의 안정성 연구 ... 36
• 4. 최적 strip 선별 ... 40
• 5. 효소시료를 생산하기위한 대량 배양했을 경우의 acetylcholinesterase의 농약에 대한 저해율 탐색 ... 41
• 6. AchE-strip생산을 위한 안정적인 효소시료의 준비 ... 42
• 7. 농약에 대한 민감도를 높이기 위한 최적의 효소농도 측정 ... 43
• 8. AchE-strip 카바메이트계, 유기인계 농약에 대한 비교실험 ... 45
• 제 2 절 기존 분석법 개량 ... 56
• 1. 브롬수(Br) 대체 기술 ... 56
• 2. 육안 판정용 발색시약 개발 ... 62
• 3. 발색시약 최적 조건 ... 63
• 4. 발색시약의 첨가 방법 간편화 기초 실험 ... 65
• 5. 최종 개발한 간이분석법 ... 66
• 6. 완성된 시제품의 형태 ... 71
• 7. 개발된 스트립 제품의 보관 중 안정성 ... 72
• 제 5 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 76
• 제 1 절 평가 착안점, 척도 및 달성도 ... 77
• 제 2 절 제1세부 strip 제작에 필요한 효소 정제, 최적 strip 선발, strip 제작 및 잔류농약 검정의 목표달성도 ... 77
• 1. 효소의 대량생산 ... 77
• 2. 효소의 정제 ... 77
• 3. 최적 스트립의 선발 ... 77
• 4. strip 제작 및 농약 검정 ... 78
• 5. 스트립 제작 후 효소의 활성도 및 안정성 ... 78
• 제 3 절 제2세부: 검사법 및 분석시약 분석 kit 실용화의 목표 달성도 ... 78
• 1. 브롬수 대체기술 개발 여부 ... 78
• 2. 발색시약의 육안 식별 여부 및 발색시약의 안정성 ... 78
• 3. 반응시간의 규격화 성공 여부 ... 78
• 4. 검사법의 간편성 ... 79
• 5. 진단의 한계 및 사용용약의 검출능력 ... 79
• 6. 기존의 방법과 스트립형 진단 결과의 정밀도 ... 79
• 제 6 장 연구개발결과의 활용계획 ... 80
• 제 1 절 추가연구의 필요성 ... 80
• 제 2 절 타연구의 응용 ... 80
• 제 3 절 기업화 추진 방안 ... 80
• 제 7 장 참고문헌 ... 85
• 끝페이지 ... 89