초록 ▼

○ 연구결과
발효공업에서 주로 사용되고 있는 버섯류, 곰팡이, 효모의 균주를 이용하여 약 50여종의 미강 발효액을 조제하고, 이들을 대상으로 4차에 걸쳐 macrophage활성, lymphocyte mitogen 활성 및 장관면역활성등 면역 증강활성에 대해 검색하였다. 그결과 Monascus pilosus로 액체 발효하여 조제한 미강 발효액 rb-C가 가장 양호한 면역 증강 활성을 보여, Monascus pilosus를 미강 발효액 생산 균주로 최종 선정하였다. 미강, 부산물 첨가와 효소처리등 배양조건을 달리하여 exo-bio

○ 연구결과
발효공업에서 주로 사용되고 있는 버섯류, 곰팡이, 효모의 균주를 이용하여 약 50여종의 미강 발효액을 조제하고, 이들을 대상으로 4차에 걸쳐 macrophage활성, lymphocyte mitogen 활성 및 장관면역활성등 면역 증강활성에 대해 검색하였다. 그결과 Monascus pilosus로 액체 발효하여 조제한 미강 발효액 rb-C가 가장 양호한 면역 증강 활성을 보여, Monascus pilosus를 미강 발효액 생산 균주로 최종 선정하였다. 미강, 부산물 첨가와 효소처리등 배양조건을 달리하여 exo-biopolymer (활성다당)의 생성량을 비교한 결과 기본배지에 미강 2%, 당밀 2.0%, CSL 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%를 첨가하여 5일 배양한 시료에서 최대의 생산을 나타내었다. Monascus pilosus 균의 미강을 포함하는 액체 및 고체 배지에서 발효액을 생산하고 그 이화학적 특성을 검토하였다. 또한 발효액의 식품가공공정 중의 macrophage phosphataseactivity와 mitogenic activity활성을 측정한 결과 ,습열, 증자, 건조조건에서도 그 활성을 유지하여 가공제품의 생산이 가능한 것으로 판단되었다. 미강발효액을 이용하여 중간제품으로 powder, granule 및 타블렛을 제조하였으며 미강발효액 음료는 황정추출물을 1.0% 첨가함으로서 이취를 효과적으로 마스킹하였으며 고과당 5.1%, 설탕 8.1%, 비타민C 0.34% 구연산 나트륨 0.34% 첨가되었을 때 가장 높은 기호도를 나타내었다. 저장성을 향상시키고 다른 관능적 품질에 영향을 최소화하기 위하여 보존제로 안식향산을 0.05% 수준으로 첨가하였다. 미강발효음료의 저장 중 품질 변화를 조사한 결과 저장기간 대부분의 항목에서 그 변화는 크지 않았다. 미강 발효액의 유효성분을 규명하고 기능성소재로써의 이용성을 검토하기 위하여 ethanol 침전, 효소처리등을 거쳐 고분자 획분(FRB)를 조제하였으며 산업화가 가능한 것으로 판단된 FRB의 in vivo 면역 증강 활성을 측정한 결과 in vivo 및 in vivo에서 각종 면역 활성이 우수한 것으로 판명되어 이상의 결과로부터 Monascus pilosus에 의해 조제된 미강발효액은 전신 면역계에 효과적으로 작용할 수 있음을 확인하였다.

Abstract ▼

IV. Results and Recommendation
P a rt I: Development of processed products from fermented rice bran products
Liquid and solid culture of rice bran with Monascus pilosus were produced and their physicochemical properties were investigated. Proximate composition of liquid fermented rice bran pro

IV. Results and Recommendation
P a rt I: Development of processed products from fermented rice bran products
Liquid and solid culture of rice bran with Monascus pilosus were produced and their physicochemical properties were investigated. Proximate composition of liquid fermented rice bran products were 93.97% for moisture, 0.3% for crude lipid, 0.73% for crude protein, 0.74% for crude ash. Proximate composition of solid fermented rice bran products were 68.1% for moisture, 6.7% for crude lipid, 4.8% for crude protein, 3.7% for crude ash. Total dietary fiber contents were 4.26%, for liquid fermented rice bran products and 16.6% for solid fermented rice bran products. Mineral and amino acid composition of liquid fermented rice bran products was also analysed. There were no heavy metal like Cd, Pb, As and P was the highest following K, Mg, Na in content. Major amino acids were aspartic acid, glutamic acid, serine and alanine. Changes of macrophage phosphatase activity and mitogenic activity during food processing procedures of Liquid and solid culture of rice bran with Monascus pilosus were investigated. Remained macrophage phosphatase activity after steaming of liquid culture were increased with treated time and temperature. Remained macrophage phosphatase activity after dry heat treatment of liquid culture were higher with higher temperature and time. Drying method did not effect the macrophage phosphatase activity after treatments. Results from remaining mitogenic activity after steaming of liquid culture showed that 45min at 95℃ was the upper limit of steaming condition but samples from 121℃ treatment retained its initial activity. Mitogenic activity after dry heat treatment of liquid culture were higher with higher temperature up to 4 hrs. Drying method did not effect the mitogenic activity after treatments. Solid solid culture of rice bran with Monascus pilosus had similar trend as liquid culture but lower activities for all samples.
Powder and granule type intermediate products from fermented rice bran products were produced and meet the standard from Food Addendum. Tablet type products were made with beer yeast to improve tablet forming property and polydextrose to improve color. Beverages from fermented rice bran products were produced by procedures to maximize yield and extractability of active compounds and minimize processing steps. Hot water extract of 황정추출물 at 1.0% level was most effective to mask off flavor but addition of cyclodextrin or maltodextrin had no additional effect on removing off flavor. Samples with 5.1% high fructose syrup and 8.1% sucrose as a sweetener were more preferred. 0.34% Ascorbic acid and 0.34% sodium citrate were chosen as a proper level of acidulant level. Peach flavor was preferred by panels most. To improve storage stability, 0.05% benzoic acid were added to final formulation. Beverages produced with final formulation were stores at 4℃, room temperature for 80 days and determined quality changes in pH, acidity, overall desirability and color. Most values were retained after storage. and acceptable.
P A R T II: Selection of strains for production of fermented rice bran and its optimization
About 50 rice bran products which were fermented by mushrooms, fungi and yeasts, were examined for their immuno-stimulating activities such as macrophage stimulating activity, lymphocyte mitogenic activity, intestinal immune system modulating activity. Among them, Asp. oryzae liquid culture(rb2) and fermented rice bran product by Monascus pilosus(rb-C as liquid and rb-3 as solid culture), showed the higher immuno-stimulating activity and rb-C was selected as the most potent candidate containing active components by showing higher values in macrophage stimulating activity, lymphocyte mitogenic activity, intestinal immune system modulating activity.
To determine production of exo-biopolymer(active polysaccharide) by enzyme treatment and by-product, different level of rice bran was added to basal media. After 5 days of cultivation, addition of 2% rice bran was best in production of exo-biopolymer. Agricultural by-products including molasses, soybean whey, yeast hydrolyzate, corn steep liquor (CSL) were added at 0.5% level to basal media including rice bran 2%, peptone 0.5%, KH₂PO₄ 0.1%. to determine exo-biopolymer production . Addition of molasses and CSL showed 14.2 mg/ml과 13.2 mg/ml production. Molasses with 0-2% addition, 0.5% and 1.0% addition showed 14.2 mg/ml과 14.3 mg/ml of exo-biopolymer production. Addition of peptone alone and pepton and 0.5% CSL to basal media was compared and media with CSL alone increased exo-biopolymer production from 13.2 mg/ml to 15.3 mg/ml.. Crude enzyme from rice bran culture with Monascus pilosus produces little exo-biopolymer after hydrolysis. Amylase and protease were added to media at 0.5% level during incubation. Addition of amylase increased macrophage activity and splenocyte proliferation compared to culture without amylase. Media consisted of rice bran 2%, molasses 2.0%, CSL 0.5%, KH₂PO₄ 0.1% and amylase 0.5% were fermented with Monascus pilosus. Changes in content of exo- biopolymer, total sugar, reducing sugar, starch, pentoses and uronic acid were determined and 5 days of incubation showed maximum production of exo-biopolymer and further incubation showed similar productions or decrease. Total sugar and reducing sugar had similar trend with production of exo-biopolymer. There was no significant changes in content of uronic acid. Pentoses were produced most after 4days of incubation.
PART III: Characterization of physiologically active components in fermented rice bran products
Mushrooms, fungi and yeasts, were used to produce fermented rice bran products containing immuno-stimulating activities such as macrophage stimulating activity, lymphocyte mitogenic activity, intestinal immune system modulating activity. Among them, rb-C, the fermented rice bran product by Monascus pilosus showed the highest immuno-stimulating activity and was selected as the most potent candidate containing active components.
The high molecular weight fraction, FRB was prepared by ethanol precipitation, amylase treatment, dialysis and lyophilization from the culture broth (rb-C) by Monascus pilosus. FRB from the fermented rice bran products showed potent stimulating activity in a dose dependent fashion toward the immune-related cells such as macrophages, lymphocytes and Peyer's patch cells. FRB fraction potently induced the production of hematopoietic growth factor (GM-CSF) and cytokines such as IL-2, IL-6, IL-12 and IFN-γ in lymphocytes. It also showed strongly augmented cytokine production (IL-1, IL-6, IL-12 and TNF-α) in macrophages. The chemical properties of FRB such as heat-stability, periodate-lability, pronase-resistance and precipitation by ethanol, indicated that the activities of FRB were due to polysaccharide moiety. The active fraction FRB which showed the highest activity, was further fractioned by anion-exchange chromatography on DEAEsepharose FF (Cl- form), and an unabsorbed fraction (FRB-a) and eleven absorbed fractions (FRB-b∼FRB-i) were obtained. Of these fractions. FRB-c and FRB-d showed the most potent immuno-stimulating activity and were purified, respectively by gel filtration on Bio-gel P-30 and/or Bio-gel A-0.5m. Among the subfractions obtained by gel filtration, three major purified polysaccharides, FRB-c-IIb, FRB-d-I, and FRB-d-II showed high immuno-stimulating activity and yield. They also enhanced the production of various cytokines in macrophages and lymphocytes. Each FRB-c-Ib and FRB-d-II were eluted as single HPLC peaks and their molecular weights were estimated to be 298 and 44 kDa, respectively. Component sugar analysis indicated that FRB-c-Ia, FRB-d-I and FRB-d-II mainly consisted of arabinose, xylose, galactose and uronic acid in addition to the small amounts of rhamnose, fucose, mannose and glucose. Methylation analysis indicated that the purified polysacharides FRB-c-Ib and FRB-d-II contained mainly of terminal-Ara, 4-/5-linked Ara and 4-/5-Xyl linkages in addition to terminal-, 6-linked , 4-linke d and 4,6-branched galactopyranosyl residues. The immuno-stimulating activities of FRB were examined in vivo. The immuno-stimulating activities were increased significantly in comparison with the control group by intravenous and intraperitoneal injection of FRB. Intravenous administration of FRB (10 mg/kg) inhibited tumor metastasis produced by colon 29-M3.1 lung carcinoma cells more than 85% as compared with the control group. Based upon these results, the rice bran products fermented by Monascus pilosus might effectively contribute to the systemic immune system to protect human bodies from several diseases and cancers.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 11
• Contents ... 18
• 목차 ... 19
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 26
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 26
• 1. 기술적 측면 ... 26
• 2. 경제ㆍ산업 적 측면 ... 29
• 3. 사회ㆍ문화적 측면 ... 30
• 제 2 절 연구개발 목표와 범위 ... 32
• 1. 연구개발 목표 ... 32
• 2. 연구 범위 ... 32
• 가. 세부과제: 미강 발효액을 소재로 한 가공식품 개발 ... 32
• 나. 협동과제: 미강 발효액 생산 균주 선정 및 생산 최적화 ... 32
• 다. 협동과제: 미강 발효액의 생리활성 성분 규명 ... 33
• 3. 연차별 연구개발목표와 내용 ... 34
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 36
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 41
• 제 1 절 미강 발효액을 소재로 한 가공제품의 개발 ... 41
• 1. 서설 ... 41
• 2. 재료 및 방법 ... 44
• 가. 시료 ... 44
• 나. 미강발효액의 이화학적 특성 ... 44
• 다. 미강발효액의 가공처리조건에서의 생리활성 잔존성 분석 ... 45
• 1) 시료제조 ... 45
• 가) 증자처리 ... 45
• 나) 건열처리 ... 45
• 다) 건조방법 ... 46
• 2) 생리 활성 측정 ... 46
• 가) Macrophage 활성 ... 46
• 나) Mitogenic activity ... 47
• 다) 장관면역 활성 측정 ... 47
• 라) ACE 저해활성 측정 ... 48
• 라. 미강발효액의 중간소재화 ... 49
• 1) 미강발효액 powder 제조 ... 49
• 2) 미강발효액 granule 제조 ... 50
• 마. 미강발효액을 이용한 가공식품제조 특성화 ... 50
• 1) 미강발효액 이용한 타블렛 제조 ... 50
• 2) 미강발효액 음료 제조 ... 52
• 가) 제조배합비 결정 ... 52
• 나) 미강발효 음료의 특성 검사 ... 53
• 3) 미강발효 음료의 저장성 시험 ... 55
• 가) 시료제조 및 저장시험 ... 55
• 나) 저장 중의 이화학적 특성 변화 ... 55
• 3. 결과 및 고찰 ... 56
• 가. 미강발효액의 이화학적 특성 ... 56
• 1) 일반성분 분석 ... 56
• 2) 식이섬유 및 유리당 함량 분석 ... 56
• 3) 무기질 조성 분석 ... 57
• 4) 아미노산 성분 분석 ... 58
• 나. 가공처리조건에 따른 생리활성 잔존성 분석 ... 60
• 1) 액체발효액의 생리활성 잔존성 ... 60
• 1) 고체 배양액 ... 65
• 라. 미강발효액의 중간소재화 ... 70
• 1) 미강발효액 powder 및 granule 제조 ... 70
• 마. 미강발효액첨가에 의한 가공식품제조 특성화 ... 70
• 1) 미강 발효액 이용한 타블렛 재조 ... 70
• 2) 미강 발효액 음료 제조 ... 71
• 가) 제조공정 ... 71
• 나) 이취 제거제 처리효과 ... 72
• (1) 생약 추출물의 처리 ... 72
• (2) cyclodextrin 및 maltodextrin 첨가 효과 ... 74
• 다) 감미료의 첨가비율 ... 75
• 라) 산미료의 첨가비율 ... 75
• 라) 향의 종류 및 첨가비율 ... 76
• 마) 최종배합비 ... 77
• 바) 저장중의 품질 변화 ... 78
• 제 2 절 미강 발효액 생산 균주 선정 및 생산 최적화 ... 82
• 1. 서설 ... 82
• 2. 재료 및 방법 ... 83
• 가. 사용균주 및 배지 ... 83
• 나. 배양조건 최적화 ... 83
• 다. 미강 농도에 의한 영향 ... 84
• 라. 부산물 첨가효과 ... 84
• 마. 당밀과 CSL 첨가 농도에 따른 효과 ... 84
• 바. 효소첨가 효과 ... 84
• 사. 활성다당 ... 85
• 아. Glucosamine 측정 ... 85
• 자. Macrophage 활성화 측정 ... 85
• 차. Mitogenic activity ... 86
• 카. 장관면역 활성 측정 ... 87
• 3. 결과 및 고찰 ... 88
• 가. 생산균주에 따른 면역 증감효과 ... 88
• 나. 면역활성 다당 최적 생산조건 확립 ... 94
• 1) 탄소원의 영향 ... 94
• 2) 질소원의 영향 ... 94
• 3) 무기질의 영향 ... 96
• 4) pH의 영향 ... 96
• 5) 배양온도의 영향 ... 98
• 6) 배양시간의 영향 ... 98
• 7) 미강 농도에 의한 영향 ... 98
• 8) 부산물 첨가효과 ... 101
• 9) 당밀과 CSL 첨가 농도에 따른 효과 ... 101
• 10) 효소첨가 효과 ... 102
• 11) 배양시 탄수화물의 동향 ... 106
• 제 3 절 미강 발효핵의 생리활성 성분 규명 ... 108
• 1. 서설 ... 108
• 2. 재료 및 방법 ... 114
• 가. 재료 ... 114
• 1) 사용균주 및 배지 ... 114
• 2) 실험 동물 ... 115
• 3) 시약 ... 115
• 4) Resin ... 115
• 나. 실험방법 ... 118
• 1) 면역활성 미강 발효액 제조를 위한 발효 균주의 screening ... 118
• 2) 일반 분석 방법 ... 118
• 3) 구성당 분석 ... 118
• 4) 면역 증강 활성 측정 ... 119
• 가) Mitogen 활성 측정 ... 119
• 나) Macrophage 활성화능 측정(Macrophage lysosomal enzyme activity) ... 120
• 다) 장관면역 활성측정 ... 123
• (1) 시료와 Peyer′s patch 세포와의 반응 ... 123
• (2) 회수한 Peyer′s patch 세포 배양액과 골수세포와의 반응 ... 123
• (3) 장관면역 활성도 측정 ... 123
• 라) 미강 발효액의 ACE 저해활성 측정 ... 125
• 마) 면역세포에 의해 생산된 cytokine 측정 ... 125
• 5) 면역 활성화 물질의 본체 규명 ... 128
• 6) 미강 발효액의 활성성분 농축을 위한 효소 처리 ... 129
• 7) 미강 발효핵 중 면역 활성화 다당의 정제 ... 129
• 가) Anion exchange chromatography(AEC) ... 129
• 나) Gel permeation chromatography ... 129
• 다) HPLC에 의한 분자량 측정 및 순도 확인 ... 130
• 8) 미강발효액 중 면역 활성다당의 구조 특성 실험 ... 132
• 9) 활성 다당의 in vivo 활성 ... 133
• 10) 미강발효액 면역활성 획분 FRB의 독성실험 ... 133
• 3. 결과 및 고찰 ... 135
• 가. 면역 활성이 우수한 미강발효핵 선별 ... 135
• 1) 미강발효액에 대한 면역활성 1차 screening ... 135
• 2) 대한 면역활성 미강발효액에 2차 screening ... 138
• 3) 미강발효액에 대한 면역활성 3차 screening ... 140
• 4) 미강발효액에 대한 면역활성 4차 screening ... 143
• 나. 미강발효액에 대한 angiotensin-converting enzyme 저해 활성 측정 ... 146
• 다. 미강발효액 중 면역활성물질의 예비 정제조건 설정 ... 149
• 1) 예비정제조건 설정을 위한 enzyme 처리 ... 149
• 2) 예비정제조건 설정을 위한 HPLC 분석 ... 150
• 라. 미강발효핵 중 면역활성 고분자 획분 FRB의 화학적 조성 ... 152
• 마. FRB획분의 면역활성 본체검토의 검토 ... 152
• 바. FRB획분이 면역세포의 cytokine 생산에 미치는 영향 ... 156
• 1) 활성획분 FRB의 자극에 의한 splenocyte의 cytokine 생산 ... 156
• 2) 활성획분 FRB의 자극에 의한 macrophage의 cytokine 생산 ... 159
• 바. FRB 획분으로부터 면역활성 다당의 분리 및 정제 ... 161
• 1) Amen exchange chromatography (AEC) ... 161
• 2) Gel permeation chromatography (GPC) ... 164
• 3) 정제획분의 면역 활성 측정 ... 168
• 4) 정제 다당의 순도 및 분자량 확인 ... 173
• 사. 미강발효액에서 정제한 면역활성 다당의 구조 특성 ... 176
• 1) 정제다당의 일반구조 특성 ... 176
• 2) 활성 다당의 결합양식 ... 178
• 아. 미강 발효액 유래 FRB획분의 in vivo 면역 증감 활성 ... 180
• 1) 활성획분의 in vivo 투여에 의한 대식세포 활성화 ... 180
• 2) 활성획분의 in vivo 투여에 의한 비장 림프구 증식활성 ... 180
• 3) 미강발효액 유래 활성획분의 시판 활성다당의 항전이 활성 비교 ... 183
• 자. 미강 발효액 유래 면역활성 다당체 FRB의 독성실험 ... 183
• 1) FRB의 경구투여 급성독성 실험 ... 183
• 2) FRB의 꼬리정맥투여 급성독성 실험 ... 185
• 3) FRB의 마우스 꼬리정맥 주사시 장기무게변화 ... 186
• 제 4 장 연구개발결과의 활용계획 ... 188
• 제 5 장 참고문헌 ... 189
• 끝페이지 ... 196