초록

○ 연구결과
고역가균주의 개량 : 2g/L : 10g/L : flask scale
발효공정의 개발 : 3g/L : 15g/L :5L-Jar scale
정제회수공정 : 80%
현장화(scale-up) : 34 ton 발효조
제제화 : formulation 표준화

Abstract ▼

IV. RESULTS AND SUGGESTIONS
1. Results
1) Establishment of analytical methods of tylosin
Analysis by HPLC :
Column ; C18, 25cm × 4.6, i.d. 5μm
Mobile phase ; 0.85M Sodium perchlorate monohydrate(pH 2.5)(60 %), Acetonitrile(40 %)
Detection ; 290 nm(UV)
2) Characterization of tylo

IV. RESULTS AND SUGGESTIONS
1. Results
1) Establishment of analytical methods of tylosin
Analysis by HPLC :
Column ; C18, 25cm × 4.6, i.d. 5μm
Mobile phase ; 0.85M Sodium perchlorate monohydrate(pH 2.5)(60 %), Acetonitrile(40 %)
Detection ; 290 nm(UV)
2) Characterization of tylosin-producing microorganism
Microbiological properties of Streptomyces fradiae, a tylosin-producer were determined.
3) Strain improvement and stabilization of hyperproducers
The experiments to improve the tylosin productivity of Streptomyces fradiae strain S.f.T, a mother strain have been continuously and repeatedly performed.
The mutant strain, H 3 obtained by mutagenesis using UV produced 10.53 g/L of tylosin.
4) Establishment of preservation methods of Streptomyces fradiae
The tylosin-producing micoorganisms displayed 92 % survival when they were preserved in a frozen glycerol(10 %) solution for a month, and 95 % survival in preservation for 4 months when they were lyophilized using 20 % skim milk.
5) Development of tylosin fermentation medium
① Fundamental culture media
SP medium was used for screening or selection of mutant strains, and NS medium and RO medium was used as a seed medium and a production medium, respectively.
② Optimization of fermentation medium
A variety of nitrogen source and carbon sources were tested about whether growth and/or tylosin productivity were promoted. The best carbon source was rapeseed oil and the mixture of fish-meal and pharmamedia was selected as a nitrogen source. Also, inorganic materials including trace elements were optimized by testing their effects on the growth and tylosin productivity. The tylosin productivity was enhanced 1.3 fold by optimization of fermentation medium.
6) Optimization of fermentation conditions
In order to establish the optimal fermentation conditions, fermentations using shake flask cultures and fermentors were performed. Fermentation time was reduced when seed cultures were divided into two stages(pre-seed and seed), and the maximum tylosin productivity was obtained when DO, agitation speed and temperature was 6.0 ppm, 600 rpm and 30℃, respectively, in a 5 L-fermentor.
When Streptomyces fradiae strain H 3, hyper-producer of tylosin, was employed and grown in the optimal fermentation medium and conditions, 15 g/L of tylosin was produced.
7) Scale-up of fermentation processes
Scale-up experiments were conducted in a 1000 L-fermentor and the fermentation conditions to obtain the level of tylosin productivity(15 g/L) equivalent to those in a 5 L-fermentor were established.
8) Development and optimization of recovery processes
Cells and solids in tylosin fermentation broth were removed by centrifugation after adjusting pH in the broth to 4.5 to increase the recovery yield of tylosin, and the recovery yield of centrifugation process was 89 %. Tylosin powder product was obtained using a spray dryer and soy bean flour was added to the tylosin solution to make the drying more efficient.
9) Formulation
In order to improve the mixing efficiency of tylosin with additives in formulation, the effects of particle size on the mixing efficiency was tested. The optimal particle size was 40 to 60 mesh. The stability test of the dried tylosin product was conducted at 40℃ and 75 % RH for a month and soy bean flour was determined to be the best stabilizer when considered the cost.
10) Test production of tylosin
The test production was conducted in a 34 kL-fermentor using Streptomyces fradiae strain H 3 and the product concentration was 14.9 g/L.
11) Analysis of production cost of tylosin
Production cost : 45 $/KgA
2. Future plan for the use of the research results and suggestion
Tylosin is one of the important antibiotics to be used as an animal feed additive and over 3 million dollars of tylosin is imported. Therefore, production of tyloin product will be initiated in near future. Governmental support will be desirable for the investment to establish the production facilities.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 21
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 26
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 29
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 30
• 제1절 실험재료 및 방법 ... 30
• 1. 균주 및 균주 보존 ... 30
• 가. 균주 ... 30
• 나. 균주보존 ... 30
• 2. 배지 ... 30
• 가. Agar 배지 ... 30
• 나. 전배양 배지 ... 31
• 다. 생산 배지 ... 31
• 3. 배양 방법 ... 31
• 가. 선별 균주 배양 ... 31
• 나. 1차 전배양 ... 31
• 다. 2차 전배양 ... 31
• 라. Flask 배양 ... 32
• 마. 5L 발효조 배양 ... 32
• 4. 분석 방법 ... 32
• 가. 균체량(PMV) ... 32
• 나. Total sugar(T.S) ... 32
• 다. Reducing sugar(R.S) ... 32
• 라. 타이로신 ... 33
• 5. 균주 개량 방법 ... 33
• 가. 변이원 처리 ... 33
• 나. 변이주 선별 ... 33
• 다. 균주 보관 ... 34
• 제2절 실험결과 및 고찰 ... 35
• 1. 타이로신 정량 방법 확립 ... 35
• 2. 타이로신 생산 균주의 특성 연구 ... 35
• 3. 타이로신 생산 균주 개량 ... 38
• 가. UV 변이 처리에 의한 사멸률 조사 ... 38
• 나. 고역가의 타이로신 생산균주 선별 ... 38
• 다. 균주 개발 요약 ... 57
• 4. 균주의 보존 방법 확립 ... 59
• 5. 기본 배양 배지 및 조건 확립 ... 59
• 가. 균주 선별 배지 ... 60
• 1) Agar 배지의 선별 ... 60
• 2) Agar 배지의 최적화 ... 61
• 나. 전배양 ... 62
• 1) 전배양 배지 ... 62
• 2) 전배양 기간 ... 64
• 6. 타이로신 발효배지 개발 ... 65
• 가. 발효배지의 선별 ... 65
• 나. 탄소원의 영향 ... 67
• 1) Corn meal의 영향 ... 67
• 2) 다양한 탄소원들의 영향 ... 68
• 3) 탄소원을 oil로 대체하였을 때의 영향 ... 69
• 4) 당밀 농도의 영향 ... 71
• 다. 질소원의 영향 ... 72
• 1) 다양한 질소원들의 영향 ... 72
• 2) 질소원 혼합첨가의 영향 ... 74
• 3) 질소원 비율의 영향 ... 74
• 라. Oil의 영향 ... 76
• 마. 무기물의 영향 ... 77
• 1) KCl의 영향 ... 77
• 2) Trace minerals의 영향 ... 78
• 3) CaCO3의 영향 ... 79
• 4) KH2PO4의 영향 ... 80
• 5) 결론 ... 81
• 7. 타이로신 발효 생산을 위한 발효 조건 최적화 ... 82
• 가. Flask ... 82
• 1) 배양 부피 ... 82
• 2) 교반 속도 ... 83
• 나. 5 L 발효조 ... 84
• 1) 1단, 2단 전배양 ... 84
• 2) Dissolved oxygen(DO)의 영향 ... 85
• 3) 교반속도의 영향 ... 86
• 4) 온도의 영향 ... 87
• 5) 접종량의 영향 ... 88
• 6) 멸균 시간에 따른 영향 ... 88
• 7) 결론 ... 89
• 8. 1 ton 발효조를 이용한 타이로신 생산 발효 ... 90
• 가. 균주 activation ... 90
• 나. 1차 종배양 ... 90
• 다. 2차 종배양 ... 90
• 라. 주배양 ... 91
• 9. 정제회수공정개발 ... 92
• 가. 보관온도에 따른 타이로신의 안정성 ... 92
• 나. 균체 분리 공정 ... 92
• 1) 균체 분리 공정 ... 92
• 2) 발효액 전처리 ... 93
• 다. 농축 공정 ... 95
• 1) 타이로신 열 안정성 ... 95
• 2) 농축 공정 ... 96
• 라. 건조 공정 ... 97
• 1) 고형분 농도 ... 97
• 2) 분무 건조 ... 98
• 3) 부형제 ... 98
• 10. 제제화 및 안정성 실험 ... 99
• 가. 제제화 실험 ... 99
• 나. 안정성 실험 ... 100
• 11. 우량균주의 타이로신 생산성 확인 ... 101
• 가. TS 3 균주 ... 101
• 나. H 3 균주 ... 102
• 12. 시험생산 ... 103
• 가. 6 ton 발효조 실험 ... 105
• 나. 34 ton 발효조 실험 ... 108
• 다. 제품화실험 ... 110
• 1) 발효액 전처리 ... 110
• 2) 균체 및 고형분의 제거 ... 110
• 3) 제품의 건조 ... 111
• 4) 제품의 원가 ... 111
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 113
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 116
• 제1절 타연구에 응용 ... 116
• 1. 고농도 생산 균주의 개발 ... 116
• 2. 발효 공정 개발 및 Scale-up ... 116
• 3. 분리정제 ... 116
• 4. 제품화 공정 ... 116
• 제2절 추가 연구의 필요성 ... 117
• 1. 균주의 개 량 ... 117
• 2. 정제방법연구 ... 117
• 제3절 기업화(상품화) 추진방향 ... 117
• 1. 제품의 Field Test (2003년 9월 → 2004년 3월 ) ... 117
• 2. 제품의 허가취득(2004년 5월경) ... 117
• 3. 정제 설비의 보완 및 신규 설치 ... 118
• 4. 본생산 및 판매 ... 118
• 제6장 참고문헌 ... 119
• 끝페이지 ... 121