초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과
제 1 절. 난각막 및 알끈의 유효성분 생산공정 및 기능성 연구
난각막과 알끈의 알카리 및 효소처리에 의한 수용화 현상과 생산된 단백질의 물리화학적 특성을 연구하였다. 알카리 처리는 NaOH 농도 0.1-2N, 에탄올 40-80%, 교반시간 6-18시간의 조건에서 가수분해하여 수용화 수율을 측정하였다. 난각막에 대한 알카리 처리의 경우 수용화 수율이 처리 조건에 따라 24.9%-73.6%를 나타내었다. 이 때 NaOH 농도 1.25N, 에탄올 70%, 교반시간 12시간에서 가장 높은 73.6%의 수율을

Ⅳ. 연구개발 결과
제 1 절. 난각막 및 알끈의 유효성분 생산공정 및 기능성 연구
난각막과 알끈의 알카리 및 효소처리에 의한 수용화 현상과 생산된 단백질의 물리화학적 특성을 연구하였다. 알카리 처리는 NaOH 농도 0.1-2N, 에탄올 40-80%, 교반시간 6-18시간의 조건에서 가수분해하여 수용화 수율을 측정하였다. 난각막에 대한 알카리 처리의 경우 수용화 수율이 처리 조건에 따라 24.9%-73.6%를 나타내었다. 이 때 NaOH 농도 1.25N, 에탄올 70%, 교반시간 12시간에서 가장 높은 73.6%의 수율을 보였다. 일반적으로 NaOH 농도와 교반시간이 증가할수록 수율이 증가하였으나, off-flavor의 발생도 함께 증가하므로 이를 고려한 최적 공정의 선정이 필요하다. 반면에 알끈의 경우에는 0.1N NaOH 용액으로 2시간 정도 가열하였을 때 완전히 수용화 하는 현상을 보였다. 난각막은 상업적으로 판매하고 있는 단백질 가수분해효소(proteases)를 가했을 때 매우 낮은 수용화 수율을 나타내었다. 따라서 앞으로 보다 효율적인 난각막 가수분해 효소시스템의 개발이 요구된다. 수용화된 난각막 및 알끈 단백질의 용해도는 93-98%로서 대부분 수용화 되었다. 분자량은 NaOH의 농도가 증가할수록 감소하는 현상을 보였다.
제 2 절. 계란 알끈을 이용한 시알릴올리고당의 생산기술에 관한 연구
시알릴올리고당(Sialyloligosaccharides)은 면역활성화 기능, 항바이러스, 항균, 항암제 등의 다양한 식품 기능성 및 생물활성을 보유하고 있어 현재 산업적으로 광범위하게 사용되고 있다.
본 연구에서 알끈의 단백질을 상업용 단백질 가수분해 효소로 가수분해함으로써 시알릴올리고당을 효율적으로 생산하는 공정을 개발하고자 하였다. 알끈은 6개의 상업용 단백질 가수분해효소 즉, Alcalase, Collupulin, Protamex, Flavourzyme, Maxazyme, Neutrase를 이용하여 가수분해 한 결과 가수분해 수율(hydrolysis yield)은 각각 98.9%, 81.4%, 68.9%, 45.0%, 35.9%, 35.6%로, 효소의 specific activity는 Alcalase 2.24 unit/㎍, Collupulin 0.58 unit/㎍, Protamax 0.24 unit/㎍, Flavourzyme 0.93 unit/㎍, Maxazyme 0.51 unit/㎍, Neutrase 0.35 unit/㎍로 결정되었다. 따라서 본 연구에서 알끈의 가수분해 수율과 효소 활성을 종합적으로 고려하여 Alcalase를 최적 효소로 선정하였다.
알끈에 대하여 Alcalase를 처리한 결과 sialyloligosaccahride에 peptide가 상당 부분 결합된 sialylglycopeptide가 생산되었다. 따라서 peptide를 제거하기 위하여
상업용 peptide 가수분해 효소인 Kojizyme, Peptidase, Protease K를 적용하였다. 그 결과 효소의 활성과 산업적인 응용성을 고려할 때 Kojizyme가 sialylglycopeptide로부터 peptide 잔기를 제거하는데 가장 바람직한 것으로 나타났다.
Alcalase와 Kojizyme을 병행처리하여 제조된 sialyloligosacchride를 Recycle Prep HPLC로 분획한 결과 두 개의 뚜렷하게 구별되는 peak를 발견할 수 있었다. 한 peak는 sialic acid 28.8%, hexose 27.9%, hexosamine 43.3%로 구성되어 있으며, 다른 한 peak는 sialic aicd 1.9%, hexose 42.6%, hexosamine 55%로 구성되어 있었다. 즉, Recycled HPLC에 의해 sialic acid의 함량이 보다 증가된 sialyloligosaccharides 분획으로 농축할 수 있었다.
본 연구는 알끈에 대해 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 protease와 peptide의 복합적 처리 공정에 의해 기능성 식품생물소재인 sialyloligosacchrides를 효율적으로 제조할 수 있음을 보여주었다. 이러한 공정은 앞으로 알끈로부터 sialyloligosacchrides를 산업적 대규모 공정으로 생산하는데 기초자료로서 활용될 것으로 기대된다.
제 3 절. 효소 가수분해 계란 알끈 펩타이드의 혈전용해활성
본 연구에서는 계란 알끈(chalaza)을 단백질 가수분해 효소로 처리하여 제조한 알끈 펩타이드의 혈전용해활성을 규명함으로써 새로운 식품 유래 펩타이드 소재로서의 가능성을 제시하고자 하였다. 기존의 혈전용해제의 대부분은 fibrinolytic enzyme으로써 인체내 존재하는 여러 효소들에 의해 가수분해 됨으로써 정작 인체내에서는 활성을 나타내지 못 할 수 있으며, 고분자 화합물이기 때문에 생체 allogenic reaction을 야기시킬 가능성이 높다. 따라서 보다 안정하며, 인체내 흡수면에서도 뛰어난 펩타이드 제제로의 개발은 중요한 의미를 갖는다. 따라서 본 실험에서는 혈전용해활성 알끈 펩타이드의 분리ㆍ정제 및 특성 규명을 통해 새로운 혈전용해제로의 가능성을 제시하고자 하였다.
단단한 구조의 불용성 알끈을 수용화하기 위하여 Alcalase, Collupulin, Flavourzyme, Kojizyme, Maxazyme, Neutrase, Protamex, Pescalase의 8종의 상업용 단백질 가수분해효소로 처리한 결과 Protamex 및 Collupulin의 가수분해율이 비교적 우수하였다. 특히 Protamex의 처리가 가수분해율 및 혈전용해 활성에도 가장 유리한 조건임을 확인할 수 있었으나 보다 우수한 가수분해 조건 및 활성 증가 조건을 탐색하기 위해 복합효소 처리를 시도했다. 그 중 Protamex 및 Kojizyme의 복합효소로 처리한 경우 가수분해율이 70.2%로 Protamex 단독 처리시 보다 13% 가량 상승하였으며, 혈전용해 활성도 Protamex 단독 처리시의 2.9%보다 약 3.3배 증가한 9.5%의 활성을 나타내었다.
혈전용해활성의 알끈 펩타이드는 ultrafiltration을 이용하여 500∼10,000 사이의 분자량 범위에서 1차적으로 분획한 다음, prep-HPLC를 이용하여 혈전용해활성을 나타내는 알끈 펩타이드를 분리하였다. MALDI mass를 이용하여 분자량을 측정한 결과 5,713 Da으로 확인되었으며, 아미노산 분석 결과 glycine의 함량이 매우 높은편이며, 그 외 serine, alanine, aspartic acid, lysine 순으로 높게 나타났다. 혈전용해활성 알끈 펩타이드(10 ㎎/㎖)는 인체내 혈전용해 물질인 plasmin (1.0 unit/㎖)과 비교하여 111.3%의 혈전용해활성을 나타내었으며, fibrinogen 용해활성도 110.3%로 유사한 결과를 나타내었다. 혈전용해활성 알끈 펩타이드의 fibrinogen degradation pattern 조사 결과 α-chain은 5분만에 완전히 분해되었고, β-chain은 1시간내에 거의 분해된 것을 확인할 수 있었다. 반면 γ-chain은 12시간 이상 반응시켜도 안정하게 존재함을 확인할 수 있었다. 혈전 내 혈전용해 기작의 간접적인 규명을 위해 혈전용해 효소인 plasmin의 전구체인 plasminogen 유무에 따른 혈전용해활성을 측정해본 결과 plasminogen free한 fibrin plate에서 보다 plasminogen rich fibrin plate에서의 혈전용해 활성이 우수한 것으로 보아 알끈 펩타이드의 혈전용해 활성은 plasminogen을 경유하는 plasminogen activator로의 기작을 예상할 수 있었다. 알끈으로부터 분리한 fibrinolytic peptide는 기존의 혈전용해제와 유사한 활성을 보임과 동시에 인체 내 흡수성 및 안정성을 고려할 때 기존의 혈전용해 효소들에 비해 그 이용성 면에서 우수할 것으로 예상된다.

Abstract ▼

IV. Results of Research
Section 1. Production and Function of Egg Shell Membrane and Chalaza Proteins
The egg shell membrane and chalaza in hen eggs were solubilized by either alkaline or protease treatments, and the soluble proteins were studied in terms of yield, solubility, molecular weight

IV. Results of Research
Section 1. Production and Function of Egg Shell Membrane and Chalaza Proteins
The egg shell membrane and chalaza in hen eggs were solubilized by either alkaline or protease treatments, and the soluble proteins were studied in terms of yield, solubility, molecular weights, emulsifications, etc. The alkaline treatments were conducted in the range of NaOH 0.1-2.0N, ethanol 40-80% and incubation time 6-18 hr. The solubilization yield for egg shell membrane by alkaline treatments ranged 24.9-73.6% and the maximum yield was obtained at 1.25N NaOH, 70% ethanol and 12hr incubation. In general, increasing the NaOH concentration and incubation time resulted in increasing the solubilization yield. On the other hand, the chalaza was completely solubilized at 0.1N NaOH and 2 hr incubation. However, the egg shell membrane was scarecely solubilized by the commercial protease treatments, which suggests the research demand for protease hydrolyzing egg shell membrane. The soluble egg shell membrane and chalaza proteins showed 93-98% solubility, and the molecular weight was decreased with increasing NaOH concentration.
Section 2. A manufacturing method of sialyloligosaccharides from the chalaza in hen's egg
Sialyloligosaccharides have been employed as functional food ingredients and biomedical agents due to its various biological activities, including immunostimulating, antivirus, antibacterial, cancer metastasis activity, etc. In this study sialyloligosaccharides were isolated from hen's egg chalaza by using edible commercial proteases. Chalaza was hydrolyzed using six proteases such as Alcalase, Collupulin, Protamaex, Flavourzyme, Maxazyme and Neutrase, in which the hydrolysis yields were 98.9%, 81.4%, 68.9%, 45.0%, 35.9% and 35.6%, respectively. The specific activities of enz ymes were determined as follows: Alcalase 2.24 unit/㎍, Collupulin 0.58 unit/㎍, Protamax 0.24 unit/㎍, Flavourzyme 0.93 unit/㎍, Maxazyme 0.51 unit/㎍, Neutrase 0.35 unit/㎍.
Alcalase was the most appropriate to hydrolyze chalaza in considering hydrolysis yield and enzyme specific activity. Alcalase hydrolysates of chalaze was further treated with peptidases such as Kojizyme, Peptidase and Protease K to get rid of the peptide residues connected to sialyloligosaccharides. In this research, considering enzymatic activity and commercial applicability, Kojizyme was selected to remove peptide from sialylglycopeptide.
The enzyme hydrolysates of chalaza were further separated by recycled prep HPLC, in which two distinct sialyloligosaccahrides were obtained. When analyzd for the composition of sialyloligosaccharides, the first fraction contained sialic acid 28.8 %, hexose 27.9% and hexosamine 43.3%, while the second fraction contained sialic aicd 1.9 %, hexose 42.6 % and hexosamine 55 %.
This research demonstrated that sialyyoligosaccahrides could be successfully isolated from chalaza by the combined treatment of commercial protease and peptidase. It is anticipated this process could be applied for industrial large-scale production of sialyloligosaccharides from chalaza.
Section 3. Fibrinolytic activity of egg chalaza peptide prepared by enzymatic hydrolysis
This study was carried out to find fibrinolytic activity from enzymatic hydrolysates of chalaza in hen eggs and to characterize biochemical properties of fibrinolytic peptide.
Chalaza was hydrolyzed using commercial protease mixtures of Protamex and Kojizyme, which were the most appropriate to solubilize chalaza in considering hydrolysis ratio and fibrinolytic activity. Chalaza hydrolysate was fractionated by ultrafiltrator and significant fibrinolytic activity was detected in the molecular weight cut-off of 50010,000.
The fibrinolytic peptide was isolated consecutively by prep-HPLC. Fibrinolytic activity was measured by the fibrin plate method.
The purified peptide showed a single band in tricine SDS-PAGE and a single spot in TLC. The elution pattern of the peptide on reverse phase-HPLC showed a single peak. Molecular weight of chalaza peptide was measured to be 5,713 Da by MALDI mass spectrometry. Amino acid analysis showed that glycine, serine, alanine, aspartic acid and lysine were the major amino acids in the fibrinolytic peptide.
The fibrinolytic peptide (10 ㎎/㎖) showed 111.3% fibrinolytic activity compared to plasmin (1 unit/㎖) and the yield of the active compound was 0.016%. The fibrinolytic activity of chalaza peptide showed concentration dependent. Chalaza peptide fraction preferentially cleaved the α-chain and relatively slowly the β-chain of fibrinogen, while γ-chain was unaffected. Fibrinolytic activity increased more significantly in plasminogen rich fibrin plate than plasminogen free fibrin plate, indicatively chalaza peptide acted as a plasminogen activator.
These results suggest that chalaza peptide could be employed as a natural thrombolytic agent in functional foods and nutraceuticals.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 12
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 20
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 24
• 1. 기술적 측면 ... 24
• 2. 경제ㆍ산업적 측면 ... 25
• 3. 사회ㆍ문화적 측면 ... 26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 28
• 1. 국외 연구현황 ... 28
• 2. 국내 연구현황 ... 32
• 3. 현재까지 연구의 문제점 ... 32
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 34
• 제 1 절. 난각막 및 알끈의 유효성분 생산공정 및 기능성 연구 ... 34
• 1. 실험 재료 및 방법 ... 34
• 가. 실험재료 ... 34
• 나. 알칼리 처리에 의한 난각막 및 알끈 단백질의 수용화의 최적화 ... 34
• 다. 난각막 및 알끈 단백질의 기능성 연구 ... 34
• (1) 난각막 및 알끈 단백질의 용해도 ... 34
• (2) 난각막 및 알끈 단백질의 유화성 ... 34
• (3) 난각막 및 알끈 단백질의 수분친화성 ... 35
• (4) 난각막 단백질의 고유점도 ... 35
• (5) 수용화된 난각막 및 알끈 단백질의 분자량 측정 ... 35
• 라. 생산 단백질에 대한 가수분해 효소 활성 연구 ... 36
• (1) 시판 단백질 분해효소의 활성연구 ... 36
• 2. 결과 및 고찰 ... 36
• 가. 알칼리 처리에 의한 난각막 및 알끈 단백질의 수용화의 최적화 ... 36
• (1) 난각막 단백질 수용화의 최적화 ... 36
• (2) 알끈 단백질 수용화의 최적화 ... 38
• 나. 난각막 및 알끈 단백질의 기능성 연구 ... 39
• (1) 난각막 및 알끈 단백질의 용해도 ... 39
• (2) 난각막 및 알끈 단백질의 유화성 ... 39
• (3) 난각막 및 알끈 단백질의 수분친화성 ... 39
• (4) 난각막 단백질의 고유점도 ... 40
• (5) 수용화된 난각막 및 알끈 단백질의 분자량 측정 ... 40
• 다. 생산 단백질에 대한 가수분해 효소 활성 연구 ... 40
• 3. 난각막 및 알끈의 현장 생산 ... 43
• 가. 난각막(Egg Shell Membrane : ESM)의 공정별 수율 ... 44
• 나. 알끈(chalazae)의 공정별 수율 ... 46
• 제 2 절. 계란 알끈을 이용한 시알릴올리고당의 생산기술에 관한 연구 ... 47
• 1. 서 론 ... 47
• 2. 실험 재료 및 방법 ... 50
• 가. 계란 알끈 시료 ... 50
• 나. 계란 알끈에 대한 단백질 가수분해 효소 처리 ... 50
• 다. Proteases에 의한 알끈 가수분해율 측정 ... 51
• 라. Proteases의 효소활성 ... 52
• 마. Sialylglycopeptide의 제조 ... 52
• 바. Sialyloligosaccharide의 제조 ... 52
• 사. Recycle HPLC에 의한 sialyloligosaccharide 분리정제 ... 53
• 아. Sialyloligosaccharide의 구성성분 분석 ... 53
• 3. 결과 및 고찰 ... 60
• 가. 상업용 Proteases의 효소활성 ... 60
• 나. 상업용 Proteases의 알끈 가수분해율 ... 60
• 다. Sialylglycopeptide의 제조 ... 61
• 라. Sialyloligosaccharide의 제조 ... 64
• 마. Recycle HPLC에 의한 sialyloligosaccharide의 분리정제 ... 68
• 바. Sialyloligosaccharide의 구성성분 분석 ... 68
• 4. 결 론 ... 73
• 제 3 절. 효소 가수분해한 계란 알끈 펩타이드의 혈전용해활성 ... 74
• 1. 서 론 ... 74
• 2. 실험 재료 및 방법 ... 80
• 가. 계란 알끈 시료 ... 80
• 나. 알끈 단백질 가수분해물의 제조 및 가수분해율 측정 ... 80
• (1) 효소별 알끈 가수분해 ... 80
• (2) Enzyme mixture에 의한 가수분해 ... 80
• (3) 효소별 알끈 가수분해율의 측정 ... 81
• 다. 혈전용해 활성 측정 ... 81
• (1) Fibrin plate를 이용한 혈전용해 활성 측정 ... 81
• (2) Fibrinogen 용해 활성 측정 ... 81
• (3) Fibrinogen 분해 pattern 조사 ... 81
• 라. 혈전용해활성 알끈 peptide의 분리ㆍ정제 ... 82
• (1) Ultrafiltration에 의한 분리 ... 82
• (2) Prep-HPLC에의한 분리ㆍ정제 ... 82
• 마. Fibrinolytic peptide의 순도 확인 ... 82
• (1) Tricine SDS-PAGE에 의한 순도 확인 ... 82
• (2) Thin layer chromatography에 의한 순도 확인 ... 83
• (3) Reverse phase-HPLC에 의한 순도 확인 ... 83
• 바. 아미노산 조성 분석 ... 83
• (1) 시료의 산 가수분해 및 전처리 ... 83
• (2) 시료 유도체화 및 HPLC를 이용한 분석 ... 84
• 사. MALDI mass에의한 분자량 측정 ... 85
• 아. Plasmininogen의 의한 혈전용해 활성 측정 ... 85
• 3. 결과 및 고찰 ... 86
• 가. 알끈 가수분해 효소의 선정 ... 86
• 나. 복합효소 처리에 따른 가수분해율 및 혈전용해 활성 ... 86
• 다. 혈전용해활성 알끈 가수분해물의 분리?정제 ... 88
• (1) Ultrafiltration에 의한 분리 및 혈전용해 활성 ... 88
• (2) Prep-HPLC에 의한 분리ㆍ정제 및 혈전용해활성 ... 90
• 라. Fibrinolytic peptide의 순도확인 및 특성 ... 93
• (1) Tricine SDS-PAGE에 의한 순도 확인 ... 93
• (2) TLC에 의한 펩타이드 분획물의 순도 확인 ... 97
• (3) Reverse phase-HPLC에 의한 순도 확인 ... 99
• 마. 아미노산 조성 ... 99
• 바. Fibrinolytic peptide의 분자량 확인 ... 99
• 사. 혈전용해활성 알끈 펩타이드의 특징 ... 99
• (1) 농도별 혈전용해 활성 ... 99
• (2) Fibrinogen 용해 활성 ... 100
• (3) Fibrinogen degradation pattern ... 100
• (4) Plasminogen 유ㆍ무에 따른 혈전용해활성 ... 103
• 4. 결 론 ... 106
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 109
• 1. 목표달성도 ... 109
• 2. 관련분야에의 기여도 ... 110
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 111
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 113
• 1. 난각막 단백질의 신규 생리활성 ... 113
• 2. 영국의 난각막 응용현황 ... 113
• 3. 미국의 난각막 이용 컨소시엄 ... 113
• 제 7 장 참고문헌 ... 115
• 제 1 절. 난각막 및 알끈의 유효성분 생산공정 및 기능성 연구 ... 115
• 제 2 절. 계란 알끈을 이용한 시알릴올리고당의 생산기술에 관한 연구 ... 116
• 제 3 절. 효소 가수분해한 계란 알끈 펩타이드의 혈전용해활성 ... 119
• 끝페이지 ... 124