초록 ▼

IV. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 무측지성 국화의 형질 발현요인 해명
국화의 무측지성은 계절에 따라 발현이 달라지며, 그 주요인은 온도인 것으로 사료되었다. 유전자원에 따라 많은 차이가 있기는 하지만 대체로 5월 하순경에 무측지성 발현이 시작되고 10월경에 다시 측지성으로 전환하는 계절적인 변화패턴을 보였다. 무측지성이 잘 발현되는 고온기에는 적심후에 불맹아 현상이 나타나므로 무적심재배를 해야 할 것으로 판단되었다.
인위적으로 주간 또는 야간 온도를 변화시켜 무측지성을 조절하려

IV. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 무측지성 국화의 형질 발현요인 해명
국화의 무측지성은 계절에 따라 발현이 달라지며, 그 주요인은 온도인 것으로 사료되었다. 유전자원에 따라 많은 차이가 있기는 하지만 대체로 5월 하순경에 무측지성 발현이 시작되고 10월경에 다시 측지성으로 전환하는 계절적인 변화패턴을 보였다. 무측지성이 잘 발현되는 고온기에는 적심후에 불맹아 현상이 나타나므로 무적심재배를 해야 할 것으로 판단되었다.
인위적으로 주간 또는 야간 온도를 변화시켜 무측지성을 조절하려는 시도는 실패하였다. 온도는 처리 당시의 온도 뿐만 아니라 그 이전에 받았던 온도 조건들이 모두 영향을 미치는 것으로 판단되었다. 외부적인 생장조절제 처리는 무측지성에 전혀 영향을 미치지 못하였다.
나. 무측지성의 변이체 유기
방사선(γ선) 처리는 당대에는 액아가 없어져 무측지성이 되었으나 월동 후이듬해 새로 신장하는 가지에는 정상적으로 액아가 착생하고 고온기에도 무측지성을 나타내지 않았다.
다. 무측지성의 유전양식
국화의 무측지성은 발현정도에 있어서 양적인 차이를 나타내어 열성호모에 의해서 좌우된다는 타 작물의 무측지성 유전양식과는 다른 결과를 나타내었다.
특히 고온기에 불맹아현상을 나타나는 기존의 측지성 품종과는 발현정도의 차이만 있을 뿐 근본적인 차이를 찾기가 곤란하였다.
라. 무측지성 국화의 유전자원 특성
33계통의 무측지성 품종 및 계통을 확보하였고 개부분은 황색계 대국이었으며, 그 중 백천하 품종은 개화기 때 최상단부의 측지가 가장 적게 발생하여 우수한 무측지성 유전자원으로 판명되었다.
마. 측지발생 관련 유전자의 탐색
측지 발달을 초기화시키는데 관련하는 조절 유전자를 찾기 위해 수행하였다.
실험수행에 있어 primer 제작은 Ls, SCR, RGA, GAI 유전자의 conserve한 domain을 중심으로 디자인하였으며 토마토 하우스 모모따로 품종과 95B1-49를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR을 실시한 후 얻은 DNA sequence를 NCBI database system를 사용해서 분석한 결과 Ls 유전자의 거의 97%와 40%의 상동성을 보여, 제작한 primer가 정확히 제작되었음을 알 수 있었다. 또한 BalII, EcoRV, Sac I으로 절단하여 genomic Southern분석을 실시한 결과, 약 7.0kb, 9.0kb 그리고 9.0, 6.5kb에서 band가 나타나 이 유전자가 single copy로 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
고온기에 측지를 유도시키기 위해 ethephon처리 후 sampling한 95B1-49를 template로 이용해서 Ls primer로 RT-PCR을 실시한 결과 3개의 band를 확인할 수 있었으며 GenBank databasde에서 sequence 분석한 결과, 세 번째 bands는 novel gene으로 확인되었다. 따라서 Ls-like gene의 full length cDNA와 genomic clones를 찾기 위해서 cDNA library를 작성하여 screening을 하였고 genomic library를 작성하여 screeing 중이다.
바. 국화 식물체 재분화 체계 확립
기내 배양된 국화 절편체로부터 직접 신초를 재분화시키는 조건을 탐색하였다. 먼저 '봉황', '수방력', '희정', '퓨마', '파소더블', '설풍'. '헤르만데분' 7 품종의 재분화력이 비교되었으며 효과적인 생장 포르몬의 종류 및 농도와, 식물 절편체의 형태 및 상태를 실험하였다. 7품종 중에서 '수방력'의 재분화율이 가장 양호하였다. 재분화된 신초수가 가장 많았던 배지의 호르몬 조성은 1.0 mg/LBA와 0.5mg/L NAA 였다. 절편체를 배지면에 수직으로 치상했을 때 신초가 가장 많이 발생했으며, 계대배양 기간에 따른 재분화율에는 차이가 없었지만 7주 배양한 것이 신초수는 많았다.
사. 국화의 형질전환 체계 확립
재분화율이 가장 높았던 '수방력'을 이용하여 형질전환 체계를 확립하고자 항생제 및 제초제 선발 농도 및 형질전환 체계를 확립하고자 항생제 및 제초제 선발 농도 및 형질전환 조건을 알아보았다. Selection marker에 대한 국화 잎절편체의 저항성 정도를 검토한 바 kanamycin은 1차 10mg/L, 2차 20mg/L로 두 번에 걸쳐 선발하는 것이 적당하였으며, 제초제 bastar는 5 mg/L가 적당하였고, 접종 후의 배지에 첨가해 주는 cefotaxime은 400 mg/L가 적당하였다. 효과적인 형질전환 조건은 항생제가 포함된 Agrobacterium 배양배지에 잎절편체를 10분간 접종 후, 공동배양배지에서 3일, cefotaxime이 첨가된 배지에서 7일간 암배양하고, 1차, 2차 항생제 선발배지에서 8~10주 배양 후 항생제에 저항성을 보이는 식물체를 선발하는 것이었다. 선발 식물체는 발근배지에서 8주간 발근을 유도하였다. Agrobacterium의 접종 농도와 접종후의 nurse culture 처리는 형질전환 효율에 큰 영향은 없었다.
아. 무측지성관련 유전자를 이용한 국화 형질전환
제2세부과제에서 분양받은 무측지 관련 유전자 STS2(parital) pCAMBIA2301 벡터에 정방향과 역방향으로 삽입 후 Agrobacterium 균주로 LBA4404 및 C58C1을 이용하여 형질전환한 결과 C58C1이 효과적이었다. C58C1 균주로 STS2를 정방향 및 역방향으로 삽입 후 형질전환시켜 PCR 및 Southern 분석 결과, 각각 10개체와 35개체의 형질전환 식물체를 획득하였다.
자. 무측지성 유전자 전환체의 주요 특성
STS2를 역방향으로 삽입 후 획득한 형질전환체 35개체들의 유전자 발현 분석 결과 모두 발현유전자를 확인하였으며, 이들을 온실에서 생육시켜 주요 특성을 조사하였다. 무측지 유전자 전환체들은 대부분 여름 고온기에 액아를 갖지 않는 무측지성을 나타내어 대조구에 비해 분명한 차이를 보였다. 다만 무측지성의 정도가 약하여 개화기에 많은 절위에서 측지성을 나타내었다.

Abstract ▼

This project, "Breeding of cultivars with nonbranching characteristic through transformation in chrysanthemum" consists of three subjects. The first is on the induction and selection of nonbranching chrysanthemum. The second is on the cloning of gene related to nonbranching in chrysanthemum. The thi

This project, "Breeding of cultivars with nonbranching characteristic through transformation in chrysanthemum" consists of three subjects. The first is on the induction and selection of nonbranching chrysanthemum. The second is on the cloning of gene related to nonbranching in chrysanthemum. The third is the development of plant to have nonbranching through transformation in chrysanthemum. The results obtained are summerized as follows;
1. Induction and selection nonbranching chrysanthemum
The nonbranching habit of chrysanthemum showed different expression levels by seasons, and temperature seemed to be a main factor. Generally it showed a seasonal pattern that its expression started on May and ended on October, although it has a big difference between genotypes. During high temperature season, when non-sprouting phenomenon appears, branching by pinch will be impossible.
Temperature treatment in order to regulate the nonbranching habit was not effective. It seemed that all temperature, in which plant was exposed, affected the expression of the nonbranching habit. External spray of plant growth regulators was also not effective.
Axillary buds were not set on the shoot grown after γirradiation, but next year they normally set on the shoot that over wintered under low temperature, in even high temperature season.
Inheritance of nonbranching habit in chrysanthemum has quantitative differences in its expression level. It is different from that of other crops that it expressed by recessive homo genes. Especially the expression has no essential difference from that of branching cultivars that has non-sprouting phenomenon in summer, except a difference in the expression level.
Characteristics of 33 nonbranching resources were investigated. Most of them have yellow, large flowers and among them, white cultivar 'Hyakutenga' was the best genotype that has little branches.
2. Cloning of gene related to nonbranching in chrysanthemum
Lateral suppressor (Ls) gene of tomato was isolated by positional cloning and was identified as a new member of the family of VHID regulatory proteins. Ls mutation showed phenotypes characteristic of the lack of lateral meristem initiation, absence of petals, and so on.
This study was carried out to investigate a regulatory gene related to the induction of development of lateral shoot in chrysanthemum. The primers were designed based on conserved domains of Ls, SCR, RGA, GAI gene, and RT-PCR was carried out in tomato cv. House Momotaro and branchless chrysanthemum line, 95B1-49.
The DNA sequence of RT-PCR products of tomato cv. House Momotaro and chrysanthemum with Ls gene of tomato showed 97% and 40% homology by using NCBI database system, respectively. Nunety seven percents homology in tomato cv. House Momotaro is confirmed that Ls primer was exactly designed for the amplification of Ls gene.
Southern analysis revealed one band with BglII (about 7.0kb), and EcoRV (about 9.0kb), and two bands with Sac I (about 9.0 and 6.5 kb), respectively. It demonstrate that the Ls-like gene in chrysanthemum genome might be one copy.
To investigate the regulation system of enthylene on the differentiation of lateral shoot, ethephon was treated in branchlessness chrysanthemum(95B1-49). In the results of RT-PCR using chrysanthemum by ethephon treatment in high temperature, we could bd confirmed the three bands. In sequencing and homology analysis for three bands, the first and the third bands confirmend as novel genes.
Therefore, we constructed and screened the cDNA libarary, and also constructed genomic library. Now, we are trying to get full length cDNA and genomic clones of Ls-like gene.
3. Development of plant with nonbranching through transformation in chrysanthemum
An efficient, high-frequency plant regeneration via shoot organogenesis was developed with allowing the genetic engineering of Dendranthema grandiflora cv. 'Subangyuk'. Adventitous shoot formation from in vitro cultured leaf explants was greatly influenced by plant growth regulator, leaf age, explant part, subcultured medium, light condition. The most efficient medium was the MS basal media supplemented with 1.0 mg/L BA and 0.1 mg/L NAA. Leaf segment explants were suppressed by kanamycin at 10~20 mg/L.
Based on the efficient regeneration protocol. a method for successful chrysanthemum transformation was developed. Leaf segment explants of 'Subangyuk' were inoculated with the disarmed strain Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 containing pCAMBIA2301, introducing lateral suppression gene, STS2 gene, as sense or antisense in the direction, for 10minutes and co-cultivated at 26℃ in dark condition for 3 days. After co-cultivation, the explants were placed on nurse-culture medium containing 400 mg/L ceforaxime in the dark condition for 7 days. After nurse-cultivation, the explants were placed on the first selection medium containing 10 mg/L kanamycin for 4~6 weeks and then were placed on the second selection medium containg 20mg/L Kanamycin for 3~4 weeks.
The shoots regenerated on the second selection medium were placed on the basal MS medium containing 400 mg/L cefotaxime to produce roots for 8 weeks. The presence of the neomycin phosphotransferase II and STS2 gene in the regenerated plants was confirmed by PCR-Southern analysis.
Forty-five plants transformed with STS2-sense and STS2-antisense were confirmend by PCR-Southern analysis. Ten among 45 plants were transformed with STS2-sense. And other 19 plants transformed with STS2-sense were confirmed by PCR analysis.
The expression of the gene of thirty-five plants transformed with STS2-antisense gene was confirmed by Northern analysis. They generally showed nonbranching habit, but the strength was weak and so they have a lot of branches on the stem.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 12
• CONTENTS ... 16
• 목차 ... 19
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 22
• 제1절 연구개발의 목적 ... 22
• 제2절 연구개발의 배경 ... 22
• 제3절 연구개발의 필요성 ... 31
• 제4절 연구개발의 범위 ... 34
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 37
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 51
• 제1절. 서론 ... 51
• 제2절 국화 무측지성의 유기 및 선발 ... 53
• 1. 무측지성 국화의 형질 발현요인 해명 ... 53
• 가. 접근 방법 ... 53
• 나. 재료 및 방법 ... 54
• 1) 무측지성의 계절적 발현시기 ... 54
• 2) 인위적 온도처리에 의한 무측지성 발현의 변화 ... 55
• 3) 생장조절제 처리에 의한 무측지성의 조절 ... 56
• 다. 결과 및 고찰 ... 57
• 1) 무측지성의 계절적 발현시기 ... 57
• 2) 인위적 온도처리에 의한 무측지성 발현의 변화 ... 74
• 3) 생장조절제 처리에 의한 무측지성의 조절 ... 79
• 2. 무측지성의 변이체 유기 ... 81
• 가. 접근 방법 ... 81
• 나. 재료 및 방법 ... 81
• 다. 결과 및 고찰 ... 82
• 3. 무측지성의 유전양식 ... 89
• 가. 접근방법 ... 89
• 나. 재료 및 방법 ... 90
• 다. 결과 및 고찰 ... 90
• 4. 무측지성 국화의 유전자원 특성 ... 95
• 가. 접근 방법 ... 95
• 나. 재료 및 방법 ... 95
• 다. 결과 및 고찰 ... 96
• 5. 적요 ... 102
• 제3절 측지발생 관련 유전자의 탐색 ... 103
• 1. 접근방법 ... 103
• 2. 재료 및 방법 ... 104
• 가. 식물재료 ... 104
• 나. Microtechnique ... 104
• 다. Total RNA의 동정 ... 104
• 라. 토마토와 국화로부터 Ls gene을 cloning하기 위한 RT-PCR ... 107
• 마. E. coli strain 과 pGEM-T Easy vector ... 107
• 바. Recombinant DNA의 competent cell로의 이동과 plasmid DNA의 동정 ... 111
• 사. DNA 염기서열과 상동성 분석 ... 111
• 아. Probe 준비 ... 112
• 자. Genomic Southern 분석 ... 112
• 차. 95B1-49로부터 측지발생에 관여하는 유전자를 RT-PCR하기 위한 호르몬 처리 ... 113
• 카. cDNA library 작성과 screening ... 114
• 타. Genomic library 작성 ... 115
• 3. 결과 ... 115
• 가. Microtechnique에 의한 apical meristem의 발생형태 ... 115
• 나. 토마토와 국화에서 측지 발달에 관여하는 Ls유전자의 RT-PCR ... 117
• 다. cDNA library 분석 ... 120
• 라. Genomic Southern 분석 ... 123
• 마. Genomic library 분석 ... 127
• 바. 측아 발달에 관련된 유전자의 발현에서 ethephon과 STS처리의 영향 ... 127
• 4. 적요 ... 135
• 제4절 국화 형질전환체 육성 ... 136
• 1. 접근방법 ... 136
• 2. 국화 식물체 재분화 체계 확립 ... 137
• 가. 재료 및 방법 ... 137
• 나. 결과 및 고찰 ... 138
• 3. 국화의 형질전환 체계 확립 ... 150
• 가. 재료 및 방법 ... 150
• 나. 결과 및 고찰 ... 151
• 4. 무측지성관련 유전자를 이용한 국화 형질전환 ... 157
• 가. 재료 및 방법 ... 157
• 나. 결과 및 고찰 ... 162
• 5. 무측지성 유전자 전환체의 주요 특성 ... 172
• 가. 재료 및 방법 ... 173
• 나. 결과 및 고찰 ... 173
• 6. 적요 ... 181
• 제5절 종합결론 ... 183
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 187
• 제1절 연도별 연구개발목표의 달성도 ... 187
• 제2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 188
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 189
• 제6장 참고문헌 ... 190
• 끝페이지 ... 196