보고서 정보
주관연구기관 |
경기대학교 Kyonggi University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2002-11 |
주관부처 |
농림부 Ministry of Agriculture and Forestry |
등록번호 |
TRKO201400023978 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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초록
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Ⅳ. 연구개발결과 및 활용에 대한 건의
인삼잎 함유 면역활성물질을 규명하고 소재화하기 위한 하고 목적으로 본 과제를 수행한 결과 획분이 다당체임을 확인하고 그 구조의 일부를 규명하였으며 자기면역 치유활성, 항보체 활성, macrophage활성, mitogen 활성, 장관면역활성 등에 대한 다수의 in vitro assay계 및 in vivo assay계를 확립하였다. 또한 각종 추출 및 정제기술을 활용하여 식품유래 면역활성물질의 소재화기술을 확보하였다. 각 세부과제별 연구개발결과를 요약하면 다음과 같다.
1) 제 1 세부
Ⅳ. 연구개발결과 및 활용에 대한 건의
인삼잎 함유 면역활성물질을 규명하고 소재화하기 위한 하고 목적으로 본 과제를 수행한 결과 획분이 다당체임을 확인하고 그 구조의 일부를 규명하였으며 자기면역 치유활성, 항보체 활성, macrophage활성, mitogen 활성, 장관면역활성 등에 대한 다수의 in vitro assay계 및 in vivo assay계를 확립하였다. 또한 각종 추출 및 정제기술을 활용하여 식품유래 면역활성물질의 소재화기술을 확보하였다. 각 세부과제별 연구개발결과를 요약하면 다음과 같다.
1) 제 1 세부과제 : 인삼잎 함유 자기면역질환 치유활성물질의 기능성 소재화
본 연구는 인삼잎으로부터 자기면역질환에 대해 치유 활성을 갖는 물질을 분리, 정제한 후 그에 대한 구조분석을 행하고 소재화하는 것을 목적으로 하였다. 인삼잎의 산지별, 추출 용매별 자기면역질환 치유활성을 glucose oxidase-anti-glucose oxidase를 이용한 면역 복합체 제거활성(immune complex clearance activity)으로 측정한 결과, 금산산의 인삼잎을 수용계 용매로 추출하였을 때 활성과 수율면에서 가장 우수한 것으로 판단되었다. 인삼잎은 100℃에서 5시간, 3회 연속추출하고, 저분자물질 및 색소를 제거하고 효율적으로 고분자 물질을 회수하기 위해 80% ethanol 침전을 행하여 활성 조다당 획분(GS-1)의 대량 추출을 행하였다.
GS-1은 Cetavlon에 의해 산성도가 다른 3개 획분 GS-2, GS-3, GS-4를 얻었으며, 이 중 약산성 획분인 GS-3가 농도의존적으로 가장 높은 활성을 나타냈다. GS-3획분 중에 존재하는 활성 본체를 규명하기 위해 GS-3를 periodate 와 pronase로 처리한 후 활성을 비교한 결과, periodate 산화처리에 의해 활성이 크게 감소한 반면 periodate 분해처리에 의해서는 뚜렷한 활성의 변화가 관찰되지 않음으로써 활성에 관여하는 물질이 다당일 가능성을 시사하였다. GS-3는 DEAE-Sepharose FF, QAE-Sepharose, Bio-gel P-30 column을 이용한 연속적인 3회의 column chromatography를 수행하여 균일한 활성 획분 GS-3c-II를 얻었다. GS-3c-II는 HPLC 상에서 분자량 11,000의 단일획분임이 판명되었으며 중성당, 산성당 및 단백질을 각각 64.1%, 33.7%, 2.2%의 비율로 함유하고 있었다. 한편 구성당 분석을 행한 결과, Apiose, 2-methyl-xylose, 2-methyl fucose, KDO, DHA등의 희귀당을 함유하고 있고 rhamnose, arabinose, galactose, galacturonic acid를 주 구성당으로 하는 총 15개 구성당이 검출되었다.
GS-3c-II의 구조분석을 위해 methyl화 분석을 통한 결합양식을 살펴본 결과, 3.4-branched fucose, 3-linked rhamnose, 2.4 branched rhamnose, 3’-linked Apiose 등 총 30여개의 linkage를 소유하고 있었으며, 1H-NMR(300 MHz) 분석 결과와 조합하여 검토해 볼 때 GS-3c-II는 repeating unit가 극도로 제한되어 있고 많은 분지쇄을 가진 복잡한 구조임을 알 수 있었다.
GS-3c-II의 미세 구조를 규명하기 위해 0.1 M TFA로 연속적인 부분 가수 분해을 행하고 이들에서 분리된 oligo 당 단편을 각종 분석 방법을 도입하여 구조 분석을 행하였다. GS-3c-II는 0.1 M TFA용액으로 40℃에서 24시간 가수분해(분해과정 1)하여, 분자량이 서로 다른 3개획분 PH-1, PH-2 및 PH-3을 얻었다. 이중 PH-3을 구성당 분석, methylation, methylated oligosaccharide의 GC-MS 해석을 행한 결과, 동 획분이 분해과정에서 GS-3c-II의 주쇄에서 분리된 Rhap-(1→5)-Kdo와 Araf-(1→5)-Dha의 구조를 갖는 것이 확인되었다. 한편 가수분해 과정에서 얻어진 중간크기의 oligosaccharide인 PH-2 획분은2-methylfucose, rhamnose, arabinose, apiose, aceric acid, galactose를 높은 비율로 함유하였으며 methyl화 분석결과에서는 terminal 2-Me-Fuc, Rha, 3-linked Rha, 2,4-branched Gal 및 2-linked AceA 등의 결합양식이 관찰되었으며 terminal Araf, 2.3-branched Arap 와 2-linked Rha등 기존 RG-II에서는 발견되지 않는 별도의 결합양식을 가지고 있었다. 한편 PH-2를 대상으로 negative FAB-MS와 FAB-B/E linked scan을 행하여 결합서열을 살펴본 결과 Aceric acid containing monoacetylated nonasaccharide의 구조를 소유하고 있음을 알 수 있었다. 한편 고분자로 남아 있던 PH-1은 다시 0.1 M TFA용액으로 40℃에서 84시간 가수분해(분해과정 2)하여, Bio-gel P-6 column으로 겔여과 하였으며 분자량이 서로 다른 4개획분 PH-1a, PH-1b, PH-1c 및 PH-1d 분획하였다. 구조분석 결과 PH-1d는 주쇄에서 잘려나온 단당류가, PH-1c는 Rhap-(1→5)-Kdo가 주로 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 PH-1b 획분에서는 2,3,4-full brached rhamnose가 관찰된 점, terminal 2-MeFucose의 존재와 높은비율로 terminal galacturonic acid linkage가 존재하는 점으로 미루어 Uronic acid rich octasaccharide 구조를 함유하는 것으로 판단되었다. 한편 PH-1a는 endo-α(1→4)-polygalac- turonase로 가수분해하고 구조 분석을 행하였다. 이상의 결과는 GS-3c-II가α(1→4) 결합의 oligogalacturonide로 하고 Rhap-(1→5)-Kdo, Araf-(1→5)-Dha, Aceric acid containing nonasaccharide와 Uronic acid rich oligosaccharide가 분지쇄를 이루고 있는 complex polysaccharide임을 알 수 있었다.
인삼잎에서 정제된 GS-3c-II가 in vitro에서 강력한 면역 복합체 제거능을 가지고 있는 것으로 나타났으므로 이들이 in vivo에서도 동일 경향을 나타내는 지 확인하기 위해 GS-3c-II를 복강 내 주사하여 macrophage를 활성화시키고, 이를 이용하여 면역 복합체 제거능을 측정하였다. 25 mg/kg 처리군에서 유의적으로 활성이 증가하는 양상을 보여 주었으며 활성화된 macrophage는 수용성 및 불용성 면역 복합체에 모두 작용함을 알 수 있었다.
또한 면역복합체 (GAG)를 꼬리정맥으로 직접 투여하고 이들의 제거능에 미치는 GS-3-c-II의 in vivo 효과를 검토한 결과 25 mg/kg과 50 mg/kg 처리군에서는 유의적으로 반감기 감소가 인정됨으로써 GS-3c-II가 체내 면역복합체 제거에 우수한 활성이 있음을 알 수 있었다.
이상의 결과로 본 시료는 in vivo 상에서 뿐만 아니라 in vitro 상에서도 잠재성 있는 면역증강제로써 작용할 것으로 사료된 바, 공업적으로 응용가능한 활성 획분 GS-1을 대상으로 기능성 음료를 제조하고 이들의 배합 조성을 결정 하였다.
2) 제 2 세부과제 : 인삼잎 함유 보체계 활성물질의 기능성 소재화
본 연구는 인삼잎으로부터 항보체 활성을 갖는 물질을 분리, 정제한 후 그에 대한 제반 특성을 규명하고, 이를 토대로 기능성 식품 소재화하는 것을 목적으로 하였다. 인삼잎의 산지별, 추출 용매별 항보체 활성을 Ig-M sensitized sheep erythrocyte를 이용 총보체용혈의 저지율(Inhibition of TCH50)로 측정한 결과, 금산산의 인삼잎의 추출물 1000 ㎍/㎖의 농도에서 ITCH50 값이 80% 내외의 높은 활성을 보였으며 열수 추출시 활성과 수율면에서 가장 우수한 것으로 판단되었다. 인삼잎은 100℃에서 5시간, 3회 연속추출하고, 80% ethanol 침전을 행하여 고분자물질을 회수하고 투석과 동결건조를 거쳐 활성 조다당 획분(GS-1)의 대량 추출을 행하였다.
GS-1은 Cetavlon을 처리하여 산성도에 따른 3개획분 GS-2, GS-3 및 GS-4로 분획하였으며 이중 GS-4가 활성과 수율의 양호한 결과를 보였다. GS-4의 화학 조성을 분석한 결과 중성당, 산성당 및 단백질의 함량이 각각68.1%, 21.2%, 10.6%로 나타났으며 이러한 결과는 시료중의 항보체 활성능이 어느 부위에 기인하는 것인지 확실히 구별할 수 없으므로 GS-4의 당 부위를 산화개열 시키는 periodate처리와 단백질부위를 가수분해하는 protease처리 및 polyphenol류를 산화시키는 chlorite처리를 행한 후 활성을 비교하였다. 미처리 GS-4의 활성과 비교했을때 protease, chlorite, polymyxin B 처리시에는 활성 변화에 큰 영양이 없었으나 periodate 처리시에는 급격한 활성의 감소가 인정됨으로써 활성에 주로 기여하는 부위는 다당류 부분임을 알 수 있었다.
GS-4는 상세한 특성을 규명하기 위해 DEAE-Sepharose FF(Cl- form)로 anion exchange chromatography를 행하여 분획하였으며 이 중 GS-4a, GS-4b 및 GS-4c가 ITCH50 값 85%이상의 고도의 활성을 나타냈다. 이들 획분은 Biogel P-30, Biogel P-100을 이용하여 gel filtration을 행하여 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb를 최종 선택할 수 있었다. 이들은 중성당 함량이 55.4∼65.2%, 산성당 함량이 30.3∼39.2%로 구성된 다당체였으며, 주로 arabinose(13.6∼22.5%)와 galactose(15.3∼34.8%)가 높은 비율로 함유하고 그외 rhamnose, fucose, xylose, mannose 및 glucose등이 소량씩 소유함을 알 수 있었다. 한편 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 HPLC를 행한 결과, 4종의 정제 다당획분은 모두 단일 peak를 나타냈으며(Fig. 3-19) 분자량은 각각 14,400 Da, 31,000 Da, 81,000 Da, 71,000 Da으로 평가되었다.
이들 정제 획분들이 보체계의 classical pathway와 alternative pathway 중 어느경로를 활성화시키는지 확인하기위해 GVB++ 기본 반응계와 2가 금속이온을 모두 제거한 EDTA-GVB-- 반응계 및 Ca++이온을 선택적을 제거한 Mg++-EGTA-GVB-- 반응계로 나누어 항보체 활성(ITCH50, %)을 측정하였다. 그 결과, 정제 활성다당들은 모두 기본반응계인 GVB++에서는 높은 활성을 보인 반면 2가 금속이온을 모두 제거한 EGTA-GVB--반응계에서는 대조구에 비하여 완전한 활성의 감소를 Mg++-EGTA-GVB--반응계에서는 20∼40%의 활성을 보였다. 또한 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb를 각각 정상인의 혈청(NHS)을 반응시킨 후 anti-human C3를 이용하여 교차 면역전기영동을 행하여 C3의 분해 산물을 동정한 결과, 활성다당들의 경우 GVB++기본반응계에서 C3의 활성화에 기인한 2개의 침강선이 관찰되었으며, alternative pathway만이 작용하도록 고안한 Mg++-EGTA-GVB-- 반응계에서는 활성화된 C3a와 C3b에 기인한 침강선이 기본반응계에 비해 상대적으로 작게 나타나 활성다당에 의한 보체계의 활성화에 alternative pathway가 일부분 관여함을 확인할 수 있었다. 한편 감작화되지않은 토끼의 적혈구를 이용한 부경로 활성화 실험에서 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb는 30-40% 정도의 IACH50 수치를 보였다. 이러한 사실은 인삼잎 활성 다당들이 보체계의 classical pathway와 alternative pathway 모두를 경유하여 강력한 항보체 활성을 보임을 재차 확인할 수 있었다.
항보체 활성 정제획분 GS-4a-I, GS-4b-I는arabinose와 galactose가 높은 비율로 함유되어 있으므로 arabinogalactan으로 존재할 가능성이 시사되었다. 그러나 β-Glucosyl Yariv antigen과의 무반응성으로 미루어, arabino-3.6- galactan 구조를 소유하지 않음을 알 수 있었다. 따라서 이들의 상세한 결합양식을 규명하기 위해 methylation analysis를 행한 결과, arabinose 결합 및 galactose 결합이 높은 비율로 존재하였으며 terminal-Ara, 4-linked 및 5-linked Ara 잔기와 4-linked Gal, 6-linked Gal 및 4,6-branched Gal 잔기가 우세하였다. 이러한 사실은 본 다당이 arabino-4-galactan으로 존재할 가능성을 강력히 시사하였으며, terminal 잔기가 많은 결과로부터 본 다당이 고도로 분지된 다당으로 존재함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Clarke가 분류한 바와 같이 arabino-4-galactan을 분지쇄로 갖는 다당체 즉 type-III의 arabinogalactan임을 알 수 있었다.
산업화가 가능하다고 판단된 GS-1획분을 대상으로 in vivo 보체계 활성화능이 측정되었다. GS-1은각각 50 mg/kg과 25 mg/kg, 0 mg/kg씩 각각 복강내에 주사하고, 혈중 보체가를 측정한 결과, 각 투여군에서 대조군에 비하여 보체가의 급격한 감소가 관찰되었다. 보체가는 초기 급격한 감소을 보이다가. 투여 4시간 이후를 경계로 회복되는 양상을 보여주었다. 이러한 결과는 보체의 활성화에 의한 것으로 이들 활성 다당 획분이 체내 보체계를 직접 활성화 할 수 있음을 시사하는 것이다. 한편 GS-1의 복강 내 투여가 C3-positive 형광세포의 유도에 미치는 영향을 검토한 결과, 회수된 macrophage 중 complement C3의 분해산물이 결합되어 있어 C3-positive한 형광성 세포는 무투여 대조군이 6.2%인데 반하여 10 mg/kg 투여군에서는 38.4%, 20 mg 투여군에서는 59.0%를 나타냄으로써 급격한 증가를 보였으며 이러한 결과는 GS-1이 complement를 활성화하여 생성된 부산물(C3b)에 의해 macrophage를 활성화할 수 있으며, 특히 활성화된 macrophage에 의해 항암활성까지도 기대할 수 있음을 시사하는 내용으로 흥미로운 결과라 할 수 있다.
이상의 결과로 GS-1은 in vivo 상에서 뿐만 아니라 in vitro 상에서도 잠재성있는 면역증강제로써 작용할 것으로 사료된 바, 배합조성을 결정하여 대표적인 기능성 식품 형태인 경질캡슐을 제작하였다
제 3 세부과제 : 인삼잎 함유 면역증강 활성화 물질의 기능성 소재화
본 연구는 인삼잎으로부터 면역 증강 물질을 분리, 정제한 후 그에 대한 제반특성을 살펴보고 구조분석을 규명하고 이를 토대로 기능성 소재화 하는 것을 주 목적으로 하였다. 활성측정은 macrophage 활성화의 경우는 murine peritoneal macrophage를 이용하여 lysosomal phosphatase activity를 측정하였으며, lymphocyte mitogen 활성이 경우 MTT assay 및 alkialine phosphatase 방법을 이용하였다. 추출 적성실험을 통하여 재료는 금산산 인삼잎이 적절한 것으로 나타났으며, 추출 용매로는 열수로 100℃에서 5시간, 3회 연속추출이 수율과 활성면에서 양호하였다. 한편 활성물질의 회수를 위해서는 80% ethanol 침전후, 투석과 동결건조하여 활성 조다당 GS-1획분을 얻을 수 있었다. GS-1은 농도의존적으로 높은 macrophage 활성과 mitogen 활성을 보였으므로 이 후의 실험에 사용되었다.
GS-1은 Cetavlon을 처리하여 산성도가 다른 3개 획분 GS-2, GS-3 및 GS-4를 얻었으며 그 중 산성다당 획분인 GS-2가 10 ㎍/㎖의 농도에서 공히 최대의 활성을 보여주었다. GS-1 중 실제 면역활성을 책임지는 본질을 확인하기 위해 periodate, pronase 및 chlorite 처리를 행한 후 활성을 비교한 결과, 두활성 공히 periodate산화와 chlorite 처리 시 활성의 현저한 감소가 이루어진 반면 pronase처리에 있어서는 상대적으로 적은 변화나 활성의 증가 양상을 보임으로써 활성화의 본체는 주로 당부위와 약간의 lignin 부위일 가능성이 높은 것으로 판단된다. 활성이 우수했던 GS-2는 DEAE-Sepharose FF (Cl- form)를 이용, 분획하였으며 이중 GS-2a, GS-2b, GS-2c 및 GS-2f가 상대적으로 높은 mitogen 활성 및 macrophage 활성을 보였으므로 이들 획분을 대상으로 Sepharose CL-6B, Bio gel P-30 및 Bio gel A-0.5m 등을 이용 젤 여과를 행하여 활성과 수율이 우수한 GS-2a-I, -2a-Ⅱ, -2b로 정제하였다. 이들 고활성 획분에 대한 화학 조성을 분석한 결과 GS-2a-I, GS-2a-Ⅱ, 및 GS-2b는 중성당 함량이 약 92%, 산성당 함량이 약 7%이고 단백질은 검출되지 않았다. 이들은 주로 galactose (37∼40%)와 glucose (13∼20%)로 구성되어 있었으며 그 외 rhamnose, fucose, arabinose, xylose, mannose, glucuronic acid 및 galacturonic acid가 소량씩 함유되어 있음을 알 수 있었다. GS-2a-I, -2a-Ⅱ 및 -2b 획분은 HPLC상에서 단일 peak로 나타났으며 분자량은 각각 144 kDa, 222 kDa, 90 kDa이었다.
GS-2a-I, GS-2a-II, GS-2b 활성 다당들은 서로 상이한 분자량을 가진 획분임에도 불구하고 비슷한 화학조성으로 구성되어 있는 사실은 이들의 구조적 유사성을 반증하였다. 한편 이들의 구조해석을 위해 methylation을 행한 결과, Galactose 잔기중에는 4-linked 결합이 전체의 20%이상을 차지하였으며, 그 외 4,6-brached Gal 및 terminal-Gal이 높은 비율로 함유된 특성을 나타냈다. 이러한 사실은 -4)-Gal-(1→4)-Gal-(1-를 주쇄로 하는 core 부분에 Gal의 C6 위치에서 side chain이 뻗어져 나가는 구조가 주로 존재하며 side chain에는 비교적 짧은 사슬이 고도로 분지되어 있음을 알 수 있었다.
한편 GS-2a-I, GS-2a-II, GS-2b의 각종 면역활성을 측정하기 위해 면역세포의 활성화, 성장 및 분화를 촉진하는 mediator로써의 기능을 담당하고 있다고 알려져 있는 cytokine 생산능을 측정하였다. 정제다당으로 lymphocyte를 자극한 후 생산되는 각종 cytokine류를 ELISA법으로 측정한 결과, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF 및 IFN-γ의 생산량 증가를 유도하였으며, macrophage를 자극한 경우에는 IL-1, IL-6 및 TNF-α을 생산하는 결과를 보여 주었다. 이러한 사실은 인삼잎 유래 활성다당이 면역세포를 자극하여 다양한 cytokine의 생산함으로써 복잡한 네트워크를 구성하고 있는 생물체의 면역계에 적용시에도 유효한 효과를 기대할 수 있다고 사료된다. 한편 GS-1이 경우 상품화되어 있는 면역활성소재인 Agaricus, AHCC, Bio-Bran보다 높은 강력한 장관면역활성을 소유한 결과를 보였으며, GS-2a-I, GS-2a-II, GS-2b로 macrophage를 자극하였을 때 탐식활성과, NO 생산능, H2O2 생산능 등을 유의적으로 증가시킴이 확인되었다.
자기면역질환 치유활성, 항보체 활성 민 각종 면역활성이 공히 높았던 인삼잎 유래 획분 중 가장 산업화가 가능할 것으로 판단된 GS-1을 대상으로 급성독성 검사를 행하였다. 면역활성 다당체 GS-1을 500, 1000, 2,500 및 5,000 mg/kg 농도로 경구 투여한 결과 모든군에서 생존율이 100%로 확인되었다.정맥 투여에 대한 급성독성의 경우 100, 250 mg/kg에서는 100%의 생존률을 보였으며 500 mg/kg농도에서만 1마리가 사멸하여 83%의 생존율을 나타내었다. 500 mg/kg이하에서는 정맥 주사하여도 독성이 거의 없는 것으로 판단되었다.
이상의 결과로 GS-1은 각종 면역활성을 공히 소유한 잠재성있는 면역증강제로써 작용할 것으로 사료된 바, 이를 이용 기능성 식품 소재로 사용하기위해 배합조성을 결정하여 과립차 형태로 제조하였다.
Abstract
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Ⅳ. Results and Proposal for Application
A. Utilization of Autoimmune Diesease Curing Materials from Ginseng Leaves
The study for extraction, pluification, characterization. and industrial application of autoimmune disease curing cornponenL from ginseng leaves was attempted. Screening of immune
Ⅳ. Results and Proposal for Application
A. Utilization of Autoimmune Diesease Curing Materials from Ginseng Leaves
The study for extraction, pluification, characterization. and industrial application of autoimmune disease curing cornponenL from ginseng leaves was attempted. Screening of immune complex cleannce activity was performed with the several solvent extracts from ginseng leaves, The hot-water extract from gmseng leaves showed considerably high activity and it was selected as the most potent candidate containing the autoimmune disease cunng components. The active poly saccharide fraction, GS-1 was prepared by ethanol precipitation, dialysis and lyophilization from the hot water extracts and then, GS-1 was fractionaied by Cetavlon treatment to give the three fractions such as GS-2, GS-3 and GS-4, Of these fractions, GS-3 showed the highest immune complex clearance activity.
GS-3 was purified by three successive colum chromatographies using DEAE-Sepharose FF (Cl form), QAE-Sepharose and Biogel P-30 to give a active polysaccharide, GS-3c-Ⅱ, The primary structure of GS-3c-Ⅱ was elucidated by composition, 1H -NMR, methyfation, and oligosaccharide analysis, GS-3c-Ⅱ consisted of at least 15 different sugars which including the rarely observed sugars, 2-Me-Fuc, 2-Me-XyI, apiose, 3-C-carboxy-5-deoxy-L-xylose (Aceric acid), 3-deoxy-D-manno-2-octurosonic acid (Kdo), 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid (Dha), Methylation and oligosaccharide structural analysis after sequential selective acid hydrolysis, provided evidence that GS-3c-Ⅱ comprised of a highly branched a-(1→4)-linked galacturooligosacchride backbone with side chains such as Rhap-(1→5)-Kdo, Araf-(1→5)-Dha, AceA-containing nonasaccharide and uronic acid-rich oligosaccharide. These results suggested that GS-3c-Ⅱ resembles, in many respects, a typical rhamnogalacturonan Ⅱ (RG-Ⅱ), a structurally complex pectic polysaccharide. The immune complex clearance activity of GS-3c-Ⅱ from ginseng leaves was examined in vivo. The immune complex clearance activity was increased significantly in comparison with the control group by intravenous injection of GS-3c-Ⅱ at dose of 25 mg/kg and 50 mg/kg. On the other hand, the drink containing the active polysaccharide, GS-1 was developed.
B. Utilization of Complement Activator from Ginseng Leaves
In this study, the leaves of P. gmseng were examined for their abilities to activatc the complement system which plays important roles in host defense systcn1 and extraction, pluification, charactclization, and industrial application of the complement activating components was performed.
A water soluble crude of polysaccharide fraction (GS-1) with anti-complementary activity has been isolated from the hot water extraet of the leaves of P. ginseng C.A Meyer. GS-1 showed relatively potent anti-complementary activity (ITCH50 more than 80% at 1000 ㎍/㎖) in a dose-dependent fashion. And then, GS-1 was fractionated by Cetavlon treatment to give the three fractions such as GS-2, GS-3 and GS-4. Of these fractions, GS-4 showed the highest anti-complementary activity and yield. In order to elucidate the real active moiety in GS-4, GS-4 was digested with protease and treated with pcriodate, chlorite and polymyxin B. The anti-complementary activity of GS-4 was not affected by protease, chlorite and polymyxin B treatment, however, markedly decreased by pcriodatc oxidation. These results suggest that the complement activation by GS-4 is mainly due to polysaccharide moiety. The active fraction GS-4 was successively purified by open column chromatographies on DEAE-Sepharose FF (Cl form), Biogel P-30 and Biogel P-100 to give the four purified polysacchmides, GS-4a-Ⅰ, GS-4b-Ⅰ, GS-4c-Ⅰa and GS-4c-Ⅱb which showed higher activities and yields. GS-4a-Ⅰ, GS-4b-Ⅰ, GS-4a-Ⅰa and GS-4c-Ⅱb were eluted as almost single HPLC peaks, and their molecular weights were estimated to be 14,400, 31,000, 71,000 and 81,000 Da, respectively. These active polysaccharides showed similar monosaccharide compositions, which contained significant portion of arabinose (13.6~22.5), galactose (15.3~34.8%) and uronic acid (30.4~39.2%) in addition to the small portion of rhamnose, fucose, xylose, mannose and glucose. Particularly the molar ratios of galactose and arabinose in the active polysaccharides were almost same (1.1~1.8). When the cross-immunoelectrophoresis with anti-human C3 serum was carried out after incubation of nonnal hunman serum with the active polysaccharides in Ca++-free condition, cleavages of C3 precipitation lines were observed. Also the anti-complementary activities of the active polysaccharides were considerably retained in the absence of Ca--ion. These results suggest that the mode of complement activation by the four active polysaccharides from P. ginseng C.A. Meyer can be via the alternative pathway as well as the classical pathvlay. Mcthylation analysis indicated that the anti complementary polysachmides GS-4a-Ⅰ and GS-4b-Ⅰ, were composed mainly of terminal-Ara, 4-linked Gal and 5-linked Ara as well as 4-linked Gal, 6-linked Gal and 4,6-branched Gal. These results suggested that GS-4a-Ⅰ and GS-4b-Ⅰ were the pectic polysaccharides with branched arabino-4-galactans. The effect of complement activation in vivo by the active fraction GS-1 was confirmed by TCH50 analysis of sera drawn from GS-1 injected guinea pIg. And increases in third component of complement (C3)-positive cells in mice treated with GS-1 suggested that GS-1 activated the complement system in vivo. On the other hand. the soft capsule containing the active polysaccharide, GS-1 was developed.
C. Utilization of Immuno-stimulator from Ginseng Leaves
In this study, the leaves of P. ginseng were examined for their inmmuno-stimuating activity and extraction, pluification, characterization, and industrial application of the complement activating components was perfonned.
A water-soluble crude polysaccharide fraction (GS-1), which was prepared from the hot water extracts of the leaves of P. ginseng, was tested for macrophage activation and mitogenic activity. GS-1 showed relatively potent mitogenic and macrophage activating ability in a dose-dependent fashion and its activity at 50 ㎍/㎖ showed higher than that of LPS. And then, GS-1 was fractionated by Cetavlon treatment to give the three fractions such as an acidic (GS-2), a weakly acidic (GS-3) and a neutral fraction (GS-4). In order to examine which moiety in (GS-2, G5-3 and G5-4 contributed to expression of the activity, the effects of chlorite treatment. pcriodate oxidation and pronase digestion were tested on the activity of GS-2, GS-3 and G5-4. The immuno-stimulating activity was considerably decreased by periodate oxidation and chlorite treatment but slightly increased or maintained by pronase digestion. These results may indicate that the lnitogenic activity and Inacrophage activation by G5-2, G5-3 and GS-4 mainly due to polysacchatide and lignin moiety. The acidic fraction G5-2, which showed the highest activity at 10 ㎍/㎖, was fluther fractioned by anion-exchange chromatography on DEAE-5cpharose FF (CI- form), and an unabsorbed fraction (G5-2) and nine absorbed fractions (GS-2b-G5-2j) were obtained. Of these fractions, G5-2a, -2b, -2c and -2f showed the most potent immuno-stimulating activity and were purified, respectively by gel filtration on Bio-gel P-30, Bio-gel A-0.5m or Sepharose CL-6B. Among the subfractions obtained by gel filtration, four major purified polysacchatides, G5-2aⅠ, 2aⅡ, -2b and -2fⅠ showed high activity. All the fractions were eluted as almost single HPLC peaks (except GS-2fⅠ), and their molecular weights were estimated to be 144,000, 222,000, 90,000 and 184,000 and 74,000 Da (GS-2fⅠ gave two co-eluted peaks), respectively. Component sugar analysis indicated that these fractions Inainly consisted of galactose(35~40%) and glucose(15~20%) in addition to rhamnose, fucose, arabinose, xylose, mannose, glucuronic acid and galacturonic acid.
Mlethylation anaysis indicated that the anti complementary polysacharides GS-2a-Ⅰ, GS-2a-Ⅱ and GS-2b andnd GS-4b-Ⅰ, were composed mainly of tenninal-Gal, 4-linked Gal and 4,6-branched Gal as well as terminal-Gle, The effect of the polysaccharides from ginseng leaves on the immune cells was investigated. The active fraction GS-1 showed more potent intestinal modulating activity than those of commercially available immuno-stimulating products, Agaricus, ATTCC. and Biobran. The purified polysaccharides. GS-2a-Ⅰ, GS-2a-Ⅱ and GS-2b potently induced cytokine production (IL-2, IL-6, IL-20 0, GM-CSF and IFN-Υ) in lymphocytes. And they also strongly augumented phagocytnsis, NO and H2O2, production, and the cytokine release (IL-1. IL-6 and TNF-α) in macrophages. No acute toxicity of G5-1 was detected in mice administered up to 5,000 mg/kg in oral, whereas 83% of survival rate in mice administerd by the intravenous injection was found at the dose of 500 mg/kg. On the other hand, the granulated tea containing the active polysaccharide, GS-1 was developed.
Based upon these results, immune response modulating effects by the polysaccharides from the leaves of Panax ginseng C.A. Mcyer might effectively enhance the systemic immune system to protect humnan bodies from several diseases and cancers.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 최종보고서 ... 2
- 제출문 ... 3
- 요약문 ... 4
- SUMMARY ... 15
- TABLE OF CONTENTS ... 23
- 목차 ... 28
- 제 1 장 서 론 ... 33
- 제 1 절 연구개발의 목적과 범위 ... 33
- 제 2 절 기술적인 측면에서의 연구개발 필요성 ... 35
- 제 3 절 경제·산업적 측면에서의 연구개발 필요성 ... 38
- 제 4 절 사회·문화적 측면에서의 연구개발 필요성 ... 39
- 제 2 장 인삼잎 함유 자기면역질환 치유 활성물질의 기능성 소재화 ... 41
- 제 1 절 서설 ... 41
- 제 2 절 재료 및 방법 ... 44
- 제 1 항 재료 ... 44
- 제 2 항 실험방법 ... 46
- 가. 자기면역 질환 치유 활성보체계 활성화 물질의 선별 ... 46
- 나. 활성 물질의 추출 ... 46
- 다. 일반 분석 방법 ... 46
- 라. 구성 당 분석 ... 47
- 마. Acetyl 함량 측정 ... 49
- 바. 자기면역 질환 치유활성 측정 ... 49
- 사. 활성화 물질의 본체 규명 ... 51
- 아. 자기면역 질환 치유활성화 다당의 분리 및 정제 ... 51
- 자. 활성 다당의 구조 분석 ... 55
- 차. 면역 복합체 제거능의 in vivo 실험 ... 58
- 카. 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 61
- 제 3 절 결과 ... 62
- 제 1 항 인삼잎으로부터 자기면역 질환 치유 활성물질의 검색 ... 62
- 가. 인삼잎의 자기면역 질환 치유활성 검토 ... 62
- 나. 추출 용매별 항보체 활성 검색 ... 63
- 다. 수용성 활성물질 추출 조건 검토 및 설정 ... 65
- 라. 활성 조다당 획분의 화학적 특성 ... 67
- 제 2 항 자기면역 질환 치유 활성 물질의 본체 분석 ... 68
- 가. Cetavlon 처리에 의한 자기면역 질환 치유활성 물질의 분획 ... 68
- 나. GS-3 획분의 자기면역 질환 활성 본체의 검토 ... 69
- 다. GS-3 획분의 불용성 면역 복합체 제거능 검토 ... 71
- 제 3 항 자기면역 질환 치유 활성화 다당의 분리 및 정제 ... 72
- 가. Anion exchange chromatography ... 72
- 나. Gel permeation chromatography ... 74
- 다. GS-3c-ll의 화학적 특성 및 활성 ... 74
- 제 4 항 자기면역 질환 치유 활성다당의 구조 분석 ... 78
- 가. β-Glucosyl Yariv antigen을 이용한 GS-3c-II의 sigle radial gel diffusion ... 78
- 나. GS-3c-II의 methyl화 분석 ... 79
- 다. GS-3c-II의 proton-NMR 분석 ... 80
- 라. 선택적 가수분해과정에서 얻어진 oligo당단편의 구조분석(분해과정1) ... 81
- 마. 선택적 가수분해과정에서 얻어진 oligo당단편의 구조분석(분해과정2) ... 88
- 바. PH-la의 endo-PGase 분해산물 분석 (분해과정 3) ... 92
- 제 5 항 면역 복합체 제거능의 in vivo 실험 ... 94
- 가. G5-3c-II의 in vivo 투여가 macrophage의 면역복합체 제거능에 미치는 영향 ... 94
- 나. GS-3c-II의 in vivo 투여가 불용성 면역복합체 제거능에 미치는 영향 ... 95
- 다. In viuo 면역 복합체 제거능 ... 96
- 라. In vivo carbon clearance 활성 ... 97
- 제 6 항 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 98
- REFERENCES ... 100
- 제 3 장 인삼잎 함유 보체계 활성물질의 기능성 소재화 ... 105
- 제 1 절 서설 ... 105
- 제 2 절 재료 및 방법 ... 110
- 제 1 항 재료 ... 110
- 제 2 항 실험방법 ... 111
- 가. 보체계 활성화 물질의 선별 ... 111
- 나. 항보체 활성 조다당의 추출 ... 112
- 다. 일반 분석 ... 112
- 라. 구성당 분석 ... 113
- 마. 항보체 활성 측정 ... 114
- 바. 항보체 활성 본질 규명 ... 116
- 사. 보체계 활성화 경로 검토 ... 117
- 아. 보체계 활성화 다당의 분리 및 정제 ... 118
- 자. 보체계 활성화 다당의 구조 특성 실험 ... 121
- 차. 활성다당의 in vivo 보체계 활성화능 실험 ... 122
- 카. 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 123
- 제 3 절 결 과 ... 123
- 제 1 항 인삼잎으로부터 항보체 활성화 물질의 검색 ... 123
- 가. 인삼잎의 산지별 항보체 활성 검토 ... 123
- 나. 추출 용매별 항보체 활성 검색 ... 125
- 다. 인삼잎 열수추출 최적 조건 검토 ... 127
- 라. 인삼잎으로 부터 열수추출 고분자 획분의 조제 및 활성 측정 ... 130
- 제 2 항 항보체 활성물질의 본체 분석 ... 132
- 가. 활성획분이 혈청 중 보체에 미치는 효과 ... 132
- 나. Cetavlon 처리에 의한 항보체 활성 물질의 분획 ... 132
- 다. G5-4 획분의 보체계 활성 본체의 검토 ... 135
- 제 3 항 보체계 활성화 다당의 분리 및 정제 ... 137
- 가. Anion exchange chromatography ... 137
- 나. Gel permeation chromatography ... 139
- 다. 정제 다당의 순도 및 분자랑 확인 ... 144
- 제 4 항 보체계 활성화 다당의 작용 양식 ... 146
- 가. GS-4 획분의 보체계 활성화 작용 양식 ... 146
- 나. 교차 면역전기영동에 의한 C3 분해 산물의 동정 ... 148
- 다. Alternative pathway를 경 유한 보체계의 활성화 ... 149
- 제 5 항 보체계 활성화 다당의 구조 특성 ... 152
- 가. 보체계 활성화 다당의 일반 구조 특성 ... 152
- 나. 보체계 활성 화 다당의 결합양식 ... 153
- 제 6 항 보체계 활성화능의 in vivo 실험 ... 155
- 가. 활성 다당의 in vivo 투여가 체내 complement 활성화에 미치는 영향 ... 155
- 나. Complement C3-positive 형광세포의 유도에 미치는 GS-I의 효과 ... 156
- 제 7 항 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 157
- REFERENCES ... 159
- 제 4 장 인삼잎 함유 면역 증강 활성화 물질의 기능성 소재화 ... 165
- 제 1 절 서설 ... 165
- 제 2 절 재료 및 방법 ... 169
- 제 1 항 재료 ... 169
- 제 2 항 실험 방법 ... 170
- 가. 면역 활성화 물질의 선별 ... 170
- 나. 면역 활성화 물질의 추출 ... 172
- 다. 일반 분석 방법 ... 172
- 라. 구성당 분석 ... 173
- 마. 면역 증강 활성 측정 ... 174
- 바. 면역 활성화 물질의 본체 규명 ... 177
- 사. 면역 활성화 다당의 분리 및 정제 ... 177
- 아. Methyl화 분석에 의한 다당의 결합위치 결정 ... 181
- 자. 기타 면역활성 측정 ... 182
- 1) 면역세포에 의해 생산된 cytokine 측정 ... 182
- 2) 장관면 역활성 측정 ... 183
- 3) Macrophage의 탐식 활성 측정 ... 184
- 4) Macrophage의 NO 생산능 측정 ... 185
- 3) Macrophage의 H₂O₂ 생산능 측정 ... 186
- 차. 면역활성 다당체 GS-1의 독성 실험 ... 186
- 카. 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 187
- 제 3 절 결과 ... 188
- 제 1 항 인삼잎으로부터 mitogen 및 macrophage 활성화 물질의 검색 ... 188
- 가. 추출 용매별 Mitogen 및 macrophage 활성화능 검색 ... 188
- 나. 열수추출 고분자 획분의 조제 및 면역증강 활성 측정 ... 190
- 제 2 항 Mitogen 및 macrophage 활성물질의 본체 분석 ... 194
- 가. Cetavlon 처리에 의한 면역증강 활성물질의 분획 및 특성 ... 194
- 나. 면역 활성 본체의 검토 ... 195
- 제 3 항 면역 활성화 다당의 분리 및 정제 ... 198
- 가. Anion exchange chromatography (AEC) ... 198
- 나. Gel permeation chromatography (GPC) ... 203
- 다. 정제 다당의 순도 및 분자량 확인 ... 209
- 제 4 항 면역활성 다당의 구조 특성 ... 212
- 가. 면역 활성화 다당의 일반 구조 특성 ... 212
- 나. 면 역 활성 다당의 결합양식 ... 213
- 제 5 항 활성 다당의 각종 면역 활성 ... 214
- 가. 활성다당이 면역세포의 cytokine 생산에 미치는 영향 ... 214
- 나. 활성다당이 장관 면역 활성화에 미치는 효과 ... 222
- 다. 정제 획분에 의한 macrophage 기능 항진 효과 ... 224
- 제 6 항 면역활성 다당체 GS-1의 독성실험 ... 227
- 가. GS-1의 경구투여 급성 독성 실험 ... 227
- 나. GS-1의 꼬리정맥투여 급성독성 실험 ... 227
- 다. Macrophage 활성 물질의 마우스 꼬리정맥 주사기 장기 무게 변화 ... 229
- 제 7 항 활성획분 기능성 소재로의 응용 방안 ... 229
- REFERENCES ... 230
- 끝페이지 ... 236
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