초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
칼슘 결합 인산화 펩타이드의 제조에 있어서 인산염을 결정하고 인산화 반응의 조건과 염화칼슘의 농도, 칼슘 결합 반응의 최적 조건을 결정하였고 그 결과 대두 펩타이드의 인산화 반응과 인산화된 펩타이드의 칼슘 결합 반응에 있어서 수소 이온 농도가 중요한 요소로 확인되었으며 무엇보다 펩타이드의 아미노산 구조가 중요하게 작용하는 것으로 확인되었다. 칼슘은 인산화펩타이드와 결합했을 때 수용액 속의 인산염 존재 조건 하 에서도 침전되지 않고 높은 용해도를 유지한다는 결과를 얻었고 실제로 동물 세포

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
칼슘 결합 인산화 펩타이드의 제조에 있어서 인산염을 결정하고 인산화 반응의 조건과 염화칼슘의 농도, 칼슘 결합 반응의 최적 조건을 결정하였고 그 결과 대두 펩타이드의 인산화 반응과 인산화된 펩타이드의 칼슘 결합 반응에 있어서 수소 이온 농도가 중요한 요소로 확인되었으며 무엇보다 펩타이드의 아미노산 구조가 중요하게 작용하는 것으로 확인되었다. 칼슘은 인산화펩타이드와 결합했을 때 수용액 속의 인산염 존재 조건 하 에서도 침전되지 않고 높은 용해도를 유지한다는 결과를 얻었고 실제로 동물 세포를 이용한 칼슘 펩타이드의 흡수도 측정 실험에서 칼슘이 소장 세포 내로 uptake되는 것을 확인하였다. 따라서 칼슘결합 펩타이드는 장내 흡수 과정에서도 침전되지 않고 수용성 칼슘의 형태를 유지할 수 있을 것으로 보인다. 이러한 결과를 토대로 산업화에 응용한다면 기존 시판 제품과는 달리, 효율적으로 장내 흡수가 가능한 형태의 칼슘 제재를 생산 할 수 있다. 당연히 기존 제품과는 충분한 가격 경쟁력이 있으며 수입 대체의 효과도 클 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Calcium works as a second messenger as well as one of the majorcomponents of bone minerals. In order to increase the total absorption levelof calcium during the intestinal absorption, a sort of soluble mineralcalcium was prepared with peptides derived from isolated soybean protein(ISP). The ISP was

Calcium works as a second messenger as well as one of the majorcomponents of bone minerals. In order to increase the total absorption levelof calcium during the intestinal absorption, a sort of soluble mineralcalcium was prepared with peptides derived from isolated soybean protein(ISP). The ISP was modified by tryptic digestion and chemicalphosphorylation using a variety of polyphosphate salts including sodiumtrimetaphosphate, and followed by calcium binding. The optimum conditionsfor the highest solubility and binding activity of calcium were established.Calcium binding property of the soybean phospho-peptides derived fromISP was compared according to their sizes and amino acid compositions.To investigate the calcium binding properties of the peptide hydrolysates indetail, the proglycinin expressed in E. coli was also purified almosthomogeneity by ammonium sulfate precipitation, ion-exchangechromatography, and cryoprecipitation. In general, shorter phospho-peptidesshowed a pronounced level of calcium binding activity than longer peptideswithout phosphorylation. The hydrophobicity of peptides does not seem tocorrelate with the calcium binding. It was observed that thephosphorylation on serine residues was crucial for calcium binding activity.The level of absorption of soluble calcium phosphopeptides through peptidetransporter was determined using a calcium sensitive reporter in animalcells. Our goals are to establish a new approach in the in vitro screeningsystem for the absorption of various forms of calcium. These data mayprovide a role of the human intestinal oligopeptide transporter in thecalcium uptake in addition to the potent application of calmodulin gene inthe calcium absorption assay with intestinal cells. These results may leadto an efficient approach in improving oral absorption of calcium or its derivatives.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 4
• CONTENTS ... 5
• 목 차 ... 9
• List of Table ... 12
• List of Figure ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 15
• 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 15
• 1. 기술적 측면 ... 15
• 2. 경제ㆍ산업적 측면 ... 17
• 3. 사회ㆍ문화적 측면 ... 17
• 2 절 연구 개발의 범위 ... 18
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 20
• 1 절 국내외 관련분야에 대한 기술개발 현황 ... 20
• 2 절 연구 결과가 국내외 기술개발현황에 차지하는 위치 ... 21
• 1. 직접적인 영향 ... 21
• 가. 고농도 고효율의 신칼슘제재 생산기술 확보 ... 21
• 나. 칼슘원자재의 정제기술 ... 21
• 다. 대두펩타이드 제조, 인산화 및 칼슘과의 효율적 결합기술 ... 22
• 라. 조직배양을 이용한 칼슘흡수도 측정기술 ... 22
• 2. 간접적인 영향 ... 22
• 가. 다른 무기염류 영양소에 대한 본 기술의 적용 ... 23
• 나. 기능과 흡수효율이 강화된 고부가가치 칼슘완제품 생산의 원료로서 사용 ... 23
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 24
• 1 절 칼슘 결합 인산화 펩타이드의 제조 ... 24
• 1. 실험적 접근 방법 및 연구 내용 ... 24
• 가. 원료 단백질의 분리 정제 ... 24
• 나. ISP 용액의 용해도를 높이기 위한 최적 조건 확립 ... 25
• 다. 가수분해 효소를 이용한 인산화 대두펩타이드 (SPP)의 생산 ... 26
• 라. 대두 단백질의 인산화 ... 30
• 마. 칼슘 결합 반응의 조건 확립 ... 34
• 바. IMAC (Immobilized metal affinity chromatography)를 이용한 proglycinin 유래의 phosphopeptide의 분리 ... 36
• 2. 연구 결과 ... 38
• 가. 원료 단백질의 분리 정제 ... 38
• 나. ISP 용액의 용해도를 높이기 위한 최적 조건 확립 ... 38
• 다. 가수분해 효소를 이용한 인산화 대두펩타이드 (SPP)의 생산 ... 40
• 라. 대두 단백질의 인산화 ... 59
• 마. 칼슘 결합 반응의 조건 확립 ... 71
• 바. IMAC (Immobilized metal affinity chromatography)를 이용한 proglycinin 유래의 phosphopeptide의 분리 ... 88
• 1) Phosphopeptide의 분리 ... 88
• 2) Proglycinin phosphopeptide의 칼슘 결합능 측정 ... 92
• 3) Mono Q 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 phosphopeptide의 분리 및 칼슘 결합능 측정 ... 92
• 2 절 인산화 펩타이드의 인산칼슘 침전 저해 ... 96
• 1. 실험적 접근 방법 및 연구 내용 ... 96
• 2. 연구결과 ... 97
• 가. 인산화 펩타이드의 인산칼슘 침전 저해 - P-Ser, P-SerSerSer vs. Ser,SerSerSer ... 97
• 나. 인산화 펩타이드의 인산칼슘 침전 저해 - P-13 amino acids vs 13 aminoacids ... 97
• 다. 인산화 펩타이드의 인산칼슘 침전 저해 - P-ISP hydrolysates vs. ISPhydrolysates ... 100
• 3 절 칼슘 펩타이드의 흡수도 ... 102
• 1. 실험적 접근 방법 및 연구 내용 ... 102
• 가. 조직배양 ... 102
• 나. Plasmids ... 103
• 다. Transient transfection ... 103
• 라. Stable transfection ... 103
• 마. Cell treatment ... 104
• 바. Luciferase assay ... 104
• 2. 연구 결과 ... 105
• 가. EDTA의 농도 결정 ... 105
• 나. Ca-P-SerSerSer의 흡수도 측정 ... 110
• 다. Ca-P-Ser의 흡수도 측정 ... 110
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 119
• 1 절 1차년도 ... 119
• 1. 연구개발 목표 ... 119
• 2. 연구평가의 착안점 ... 120
• 3. 연구개발 목표의 달성도 ... 121
• 가. 원료 대두단백질 및 칼슘 정제 ... 121
• 나. 인산염 중합체 및 인산화 대두펩타이드의 제조 ... 122
• 다. 칼슘-SPP 결합 및 예비시제품 제조 ... 122
• 4. 관련 분야의 기술발전에의 기여도 ... 123
• 2 절 2차년도 ... 124
• 1. 연구개발 목표 ... 124
• 2. 연구평가의 착안점 ... 125
• 3. 연구개발 목표의 달성도 ... 126
• 가. 중합도별 인산염을 이용하는 단백질 인산화 반응의 최적 조건 확립 ... 126
• 나. 인산화 반응 상등액 속의 잔여 인산염 및 그 분해 유도체들의 침전방지 방법 확립 ... 127
• 다. 우수 칼슘 결합성 대두 peptide의 유전자 클로닝 및 재조합 대장균에서의 대량 발현 관련 기초 실험 ... 127
• 4. 관련 분야의 기술발전에의 기여도 ... 128
• 3 절 3차년도 ... 129
• 1. 연구개발 목표 ... 129
• 2. 연구 평가의 착안점 ... 130
• 3. 연구 개발목표의 달성도 ... 130
• 가. Affinity chromatography를 이용한 칼슘 결합 가능 대두 펩타이드의 분리 및 정제 ... 130
• 나. 칼슘 밀도 및 용해도 최적화 방법 확립 ... 131
• 1) 고밀도 칼슘결합 펩타이드 생산의 최적화 ... 131
• 2) 고수용성 칼슘의 제조 ... 132
• 3) 조직배양에 의한 칼슘-SPP의 흡수율 측정 ... 132
• 4) 칼슘-SPP의 최적 조건에 따른 최종 시제품 제조 ... 133
• 4. 관련 분야의 기술발전에의 기여도 ... 133
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 135
• 1 절 추가 연구의 필요성 ... 135
• 1. 대두단백질의 가수분해 및 인산화에 의한 칼슘 결합능과 제품수율 향상 ... 135
• 2. 기능성 인산화 대두펩타이드-칼슘 제조 ... 135
• 2 절 타 연구에의 응용 ... 136
• 3 절 기업화 추진방안 ... 136
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 139
• 제 7 장 참고문헌 ... 141
• 끝페이지 ... 147