초록

○ 연구결과
본 연구를 통하여 C. sakazakii collection을 완성하였고 C. sakazakii에 특이적으로 작용하는 bacteriophage를 12주 분리하였으며 이를 이용한 C. sakazakii의 sanitizer로의 개발, C. sakazakii의 신속검출법으로의 활용이 가능하겠다. 그리고 C. sakazakii에 길항적으로 작용하는 B. animalis BF8를 분리하였고 bacteriocin-like substance를 확인하였으며 이를 조제 분유등의 첨가물로 활용이 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼

We researched for development of complex control of Enterobacter sakazakii and produce of safety food additives for baby foods such as infant formula. E. sakazakii{Cronobacter spp.) is a widespread bacteria newly emerging high hazard pathogen, which causes encephalomeningitis, hematosepsis and necro

We researched for development of complex control of Enterobacter sakazakii and produce of safety food additives for baby foods such as infant formula. E. sakazakii{Cronobacter spp.) is a widespread bacteria newly emerging high hazard pathogen, which causes encephalomeningitis, hematosepsis and necrotic colitis in infant formula and baby food. As a study of method to control and produce of safe infant formula, we selected C. sakazakii virulent bacteriophage and lactic acid bacteria and developed the optimum condition of controlling C. sakazakii and produce safety infant formula using complex handling of lactic acid bacteria and bacteriophage.
To identify C. sakazakii from infant formula, baby food, grain powder, raw food, crops and salad, we primary isolated 132 strains from it and final identification of 112 C. sakazakii by checking the biochemical characteristics, Vitek, PCR etc.. General Cronobacter spp. isolates showed high sensitivity at ampicillin, tetracycline, chlorampenicol but it has high resistance at streptomycin. 90% of C. sakazakii isolates had strong resistance at drying and does were also having high biofilm formation ability. We isolated 12 virlulent phages which doesn't formate plaques in other food-borne pathogens, 7 from swine feces sample, 3 from Kimchi, 2 from sewages. Host inhibition spectrum was 19%-58% of 112 Cronobacter spp. isolates and appeared growth impeding characteristic. Most isolated virulent phages belongs to Myovirdae family, but some of these belongs to Siphoviridae family such as ESSI-3 phage. We checked the MOl by effections of EH and other major phages about C. sakazakii growth impeding characteristic, when MOl is 0.1, C. sakazakii was not detected after 6hours. We treated 6 mixed major virulent phages in C. sakazakii contaminated infant formula, initial total bacterial count has remained or decreased in principle. When use of phage cocktail at 23 high secretion biofilm C. sakazakit: we checked the markedly decrease after 12hour treatment. Bifidobacterium anima/is BF-8 and lactic acid bacteria had the most powerful antimicrobial effects to Cronobacter spp., in 18 lactic acid bacteria isolates and when mixed with 4 virluent phages, C. sakazakii was not detected. Also we checked similar results at application of infant formula. Meanwhile we confirmed the inducement of temperate phage from C. sakazakii KYU90 by heatshock, such being the case we could get interesting information controling Cronobacter spp. using heat treatment.
We performed detection of Cronobacter spp. by Phage amplification assay using isolated virluent bacteriophage cocktail. We need more than 3hours of incubating time if it has low dose of C. sakazakii in contaminated food. Bacteriophage was shown after treating phage cocktail in infant formula, vegetable juice, cabbage contaminated by C. sakazakii ATCC29544. When detecting Cronobacter spp. using phage amplification assay, we should remind effects of initial bacteria count and food ingredients, pH, inhibitors, food properties. For detection of wild type Cronobacter spp. isolates using phage amplification assay, about 2 log CFU/mL level of C. sakazakii was able to detect and detection time was not more than 20 hours, because of merits and demerits of high host specifics, we think it could be a very effective detection assay.
We identified 16 bifidobacteria which has antimicrobial effects at Cronobacter spp. and Bifidobacterium animalis BF-8 lactic acid bacteria was the most outstanding strain of the others. B. animalis BF8 secretes bacteriocin-like substance and we confirmed the growth impeding characteristic of C. sakazakii when added in infant formula. For the use of it in commercial, we checked cytotoxicity by analysing MTT of Hep-2 cell, there was no toxicity phenomenon. For the produce of commercial B. animalis BF8 pilot, it took 3 hours of lag phase, 10 hours of log phase and finally epoch to the stational phase after 13 hours. Also we produce prototype of lyophilization solution which cover 1.5☓10¹¹ CFU/g and this is up proportionately to other commercial lactic acid bacteria, so it has no probs to make it into products. Therefore these micro ferment products could be confricated and produce it to manufactured goods.
We have completed Cronobacter spp. collection by this research, and isolated 12 host specific bacteriophages, development uses of it as a sanitizer agent, and use of rapid detection method of C. sakazakii. Also we isolated B. animalis BF8 effects antimicrobial to C. sakazakii and confirmed bacteriocin-like substance, so we could use as an additive in modified milk powder.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 5
• 목차 ... 7
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 10
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 10
• 1. 연구 개발 대상 기술의 경제적.산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 10
• 가. Bacteriophage를 이용한 E. sakazakii의 효율적인 제어법 개발 ... 10
• 나. 유산균과 bacteriophage 복합처리를 통한 C. sakazakill제어 기술 개발 ... 13
• 제2절 연구개발 목표 및 범위 ... 16
• 1. 연구개발의 최종목표 및 주요 범위 ... 16
• 2. 과제별(세부) 연구개발의 목표 및 내용 ... 17
• 3. 연차별 연구개발의 목표 및 내용 ... 18
• 4. 연구 추진 일정 ... 20
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 21
• 제1절 국외 관련 연구 현황 ... 21
• 제2절 국내 관련 연구 현황 ... 22
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 23
• 제1절 Enterobacter sakazakii(Cronobacter spp.) 분리 및 동정 ... 23
• 1. 재료 및 방법 ... 23
• 가. 사용 균주 ... 23
• 나. MPN법에 따른 정량적 검출 방법 ... 23
• 다. VITEK을 이용한 C. sakazkaii의 동정 ... 25
• 라. Polymerase chain reaction (PCR)을 이용한 C. sakazkaill의 동정 ... 25
• 마. 16s rRNA sequence를 통한 homology ... 26
• 바. 건조 특성에 따른 C. sakazkaill의 생리 특성 ... 27
• 사. 건조 분말 식품 내에서의 생육 특성 ... 27
• 아. 건조 특성에 따른 biofilm 형성 특성 ... 27
• 자. 분리된 Cronobacter spp.의 열감수성 특성 ... 28
• 차. Sanitizer를 이용한 C. sakazakill제어농도 측정 ... 28
• 카. 분리된 Cronobacter spp.의 세포 독성 시험 ... 31
• 2. 결과 및 고찰 ... 32
• 가. 다양한 식품 중에 일반 세균 오염도 ... 32
• 나. VITEK과 PCR에 의한 C. sakazkaill의 분리, 동정 ... 34
• 다. 분리된 Cronobacter spp.의 항생제 감수성 특성 ... 43
• 라. 건조에 따른 C. sakazkaill의 특성 ... 45
• 마. 건조분말 식품 내에서 C. sakazkaill의 생육 특성 ... 47
• 바. C. sakazkaill의 biofilm 특성 분석 ... 49
• 사. 분리된 Cronobacter spp.의 열감수성 특성 ... 54
• 아. Sanitizer를 이용한 C. sakazkaill제어농도 측정 ... 56
• 자. 분리된 Cronobacter spp.의 세포 독성 시험 ... 59
• 제2절 E. sakazakill(Conobacter spp.) 용균성 파지의 분리 ... 61
• 1. 재료 및 방법 ... 61
• 가. 분리원 및 용균성 파지의 분리 ... 61
• 나. 숙주저해범위 분석 ... 61
• 다. 분리 파지의 형태학적 특성 ... 62
• 라. 파지 DNA 추출 ... 62
• 마. 분리된 용균성 파지에 대한 genome sequence 분석 ... 62
• 2. 결과 및 고찰 ... 64
• 가. C. sakazakill의 용균성 파지의 분리 및 숙주 저해 특성 ... 64
• 나. 분리 파지의 형태학적 특성 ... 71
• 다. 파지 DNA 추출 ... 74
• 라. 분리된 용균성 파지에 대한 genome sequence 분석 ... 76
• 제3절 E. sakazakill(Cronobacter spp.)용균성 파지를 이용한 식품 적용 ... 82
• 1. 재료 및 방법 ... 82
• 가. 분리된 파지를 이용한 C. sakazakill의 생육 억제 ... 82
• 나. Bacteriophage를 이용한 식품 중 C. sakazkaill의 저감화 ... 82
• 다. 분리된 용균성 파지를 이용한 biofilm의 제어 ... 82
• 라. Bifidobacterium, 유산균과 용균성 파지를 이용한 C. sakazakill의 제어 ... 83
• 마. C. sakazakill KYU90으로부터 temperae phage의 분리 및 특성 분석 ... 83
• 2. 결과 및 고찰 ... 86
• 가. 분리된 파지를 이용한 C. sakazakill의 생육 억제 ... 86
• 나. Bacteriophage를 이용한 식품 중 C. sakazkaii의 저감화 ... 90
• 다. Bacteriophage를 이용한 biofilm의 제거 효과 ... 95
• 라. Bifidobacterium., 유산균, 용균성 파지를 이용한 C. sakazakii의 제어 ... 102
• 마. C. sakazakill KYU90으로부터 temperae phage의 분리 및 특성 분석 ... 108
• 제4절 Cronobacter spp.의 검출을 위한 용균성 파지의 이용 ... 118
• 1. 재료 및 방법 ... 118
• 가. 분리된 용균성 파지들의 ferrous ammonium sulfate에 의한 제거 ... 118
• 나. Phage amplification assay에 의한 C. sakazakii의 검출 ... 118
• 다. 식품에 오염된 Cronobacter spp. 검출 ... 119
• 라. Cronobacter spp. 분리주를 대상으로한 식품 적용 ... 119
• 2. 결과 및 고찰 ... 120
• 가. 분리된 용균성 파지들의 ferrous ammonium sulfate에 의한 제거 ... 120
• 나. Phage amplification assay에 의한 C. sakazakii의 검출 ... 123
• 다. 식품에 오염된 Cronobacter spp.의 검출 ... 126
• 라. Cronobacter spp. 분리주를 대상으로한 식품 적용 ... 128
• 제5절 C. sakazkaill 길항성 유산균 및 Bifidobacterium 분리 ... 130
• 1. 재료 및 방법 ... 130
• 가. 발효식품으로부터 유산균의 분리 ... 130
• 나. 발효 식품으로부터 Bifidobacterium의 분리 ... 130
• 다. 분리된 유산균 및 Bifidobacterium에 의한 C. sakazkaii의 길항 작용 ... 131
• 라. 선발균주의 생육특성 분석 ... 131
• 마. Bifidobacterium BF-8의 bacteriocin의 정체 ... 135
• 바. Bifidobacterium BF-8의 cell cytotoxicity ... 135
• 사. Pilot 생산 ... 136
• 2. 결과 및 고찰 ... 137
• 가. 발효식품으로부터 유산균의 분리 ... 137
• 나. 유아 분변으로부터 Bifidobacterium의 분리 ... 140
• 다. 유산균과 Bifidobacterium의 C. sakazkaill에 대한 저해 효과 ... 150
• 라. 선발균주의 생육특성 분석 ... 160
• 마. Bifidobacterium BF-8의 bacteriocin like substance의 분리 ... 175
• 바. Bifidobacterium BF-8에 대한 cell cytotoxicity ... 177
• 사. Pilot 생산 배양 ... 179
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 182
• 제1절 목표달성도 ... 182
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 184
• 제1절 실용화.산업화 계획(기술실시 등) ... 184
• 제2절 교육.지도.홍보 등 기술확산 계획 등 ... 184
• 제3절 특허, 품종, 논문 등 지식재산권 확보계획 등 ... 184
• 제4절 추가연구, 타연구에 활용 계획 등 ... 185
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 186
• 제1절 본 연구관련 국내외 기술수준 비교 ... 186
• 제2절 논문, 특허 및 시장 분석 ... 187
• 1. 논문 ... 187
• 2. 특허 ... 188
• 3. 시장현황 ... 188
• 가. 국내 제품생산 및 시장 현황 : 없음 ... 188
• 나. 국외 제품생산 및 시장현황 ... 188
• 제7장 참고문헌 ... 190
• 끝페이지 ... 198