초록 ▼

○ 연구결과
▸ 백신 연구를 위해서는 바이러스에 감염되지 않은 양식새우가 필요하지만 자연 생태계 또는 양식장에서는 WSSV에 감염되지 않은 새우를 구하기 어렵기 때문에 민물 새우인징거미새우 (Macrobrachium nipponense )를 본 연구의 모델 시스템으로 개발.
▸ WSSV에 감염된 흰다리새우를 징거미새우에 먹였을 경우 3주 후 30%의 폐사율 보였으며, 순수분리된 WSSV를 장어먹이에 혼합 공급하였을 경우 3주 후 90%의 폐사율을 보였고 순수분리된 WSSV를 2.5 × 104, 900 and 80 copi

○ 연구결과
▸ 백신 연구를 위해서는 바이러스에 감염되지 않은 양식새우가 필요하지만 자연 생태계 또는 양식장에서는 WSSV에 감염되지 않은 새우를 구하기 어렵기 때문에 민물 새우인징거미새우 (Macrobrachium nipponense )를 본 연구의 모델 시스템으로 개발.
▸ WSSV에 감염된 흰다리새우를 징거미새우에 먹였을 경우 3주 후 30%의 폐사율 보였으며, 순수분리된 WSSV를 장어먹이에 혼합 공급하였을 경우 3주 후 90%의 폐사율을 보였고 순수분리된 WSSV를 2.5 × 104, 900 and 80 copies 주사하였을 경우 주사 12일 이전에 각각 100%, 100%, 50%의 폐사율을 보이는 것을 확인하여 징거미새우를 WSSV의 감염모델로 사용할 수 있음을 확인.
▸ WSSV에 내성인 것으로 알려진 흰다리새우에서 WSSV가 최근 심하게 발생하고 있어 WSSV의 유전적 변화를 알아보기 위하여 국내의 흰다리새우로부터 분리한 WSSV 전체 게놈을 분석한 결과, 그 크기는 295,884 bp였으며 515개의 ORF 중 90개는 기본에 보고된 단백질들과 상동성을 보이지 않음.
▸ 백신 유전자의 발현을 우한 프로모터로 olyhedrin promoter와 WSSV ie1 promoter 선별하고 이 프로모터에 eGFP 유전자가 전자가 삽입된 베큘로바이러스를 제작하고 침지법과 먹이에 섞어 주는 방법을 통해 새우에서 재조합 베큘로바이러스의 전달 효능을 평가.
▸ 비중식성 베큘로바이러스 시스템을 이용하기 위하여 WSSV의 vp28 유전자외 vp19 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 만 bac-to-bac system을 이용하여 제작.
▸ 제작된 백신의 항원력을 알아보기 위하여 BALB/c 마우스를 이용하여 항체를 생산하고 생성된 항체에 의한 바이러스 중화 능력을 조사함
▸ 최종적으로 제작된 6종의 백신 후보를 대상으로 징거미새우에 대한 효과 검정을 실시한 결과 백신 미처리 그룹은 100%의 폐사를 보인반면 백신을 처리한 그룹에서는 10.2-33%의 폐사율을 보였으며, 특히 WSSV의 VP28, VP19 유전자와 Salmonella의 flagellin 유전자로 구성된 백신인 Ac-VP28-ie1VP19+STF2가 가장 효과 있는 결과를 보임
▸ 징거미새우에 대하여 가장 우수한 효과를 보인 Ac-VP28-ie1VP19+STF2 백신을 대상으로 흰다리새우에서의 백신효과를 비교한 결과 백신 미처리 그룹은 100%의 폐사를 보인반면 백신을 처리한 그룹에서는 22%의 폐사율을 보여 백신으로 효과가 있음을 확인 하였음
▸ 선별된 유전자 백신인 Ac-VP28-ie1VP19+ STF2를 대 백신의 생산은 SF9 cell에서 amplify 한 후, ultracentrifuge를 통해 농축함으로써 이루어졌으며, 대량으로 생산하기 위해 roller bottle을 이용하여 대량 생산을 구축
▸ 대량생산된 백신을 이용하여 “AVIS’라는 시제품을 제작하였으며, 이 백신을 이용하여 시험 적용한 결과 10%의 폐사율을 나타냄.
▸ 또한, ‘AVIS’의 1/10 농도와 BEI로 불활성화한 베큘로바이러스 백신의 경우도 각각 20%와 15%의 폐사율을 보여 백신으로 충분한 것으로 확인됨

Abstract ▼

White spot syndrome virus (WSSV) is an infectious pathogen of penaeid shrimp and other crustaceans causing large economic losses all over the world. However, there is no efficient vaccines, adequate treatments, or approach to control this virus.
In this project we have tried to produced recombin

White spot syndrome virus (WSSV) is an infectious pathogen of penaeid shrimp and other crustaceans causing large economic losses all over the world. However, there is no efficient vaccines, adequate treatments, or approach to control this virus.
In this project we have tried to produced recombinant vaculovirus that is not replicating in the shrimp tissue but can effectively deliver the vaccine to shrimp tissue and the major accomplishment are as follow;
○ WSSV infection model system was developed by using a fresh water shrimp, Macrobrachium nipponense, because virus free shrimp necessary for vaccine development is not available from nature or aquaculture farm.
○ In the feeding test of M. nipponense fed with WSSV infected Litopenaeus vannamei showed 30% cumulative mortality by 3 weeks post-infection. M. nipponense fed with purified WSSV mixed with eel feed showed 90% cumulative mortality. M. nipponense injected with 2.5 × 104, 900 and 80 copies/g body weight exhibited 100, 100 and 50% final mortality at 2, 10and 12 days post inoculation, respectively
○ L. vannamei was known to be more resistant to WSSV infection but showing severe infection these days. Therefore, the entire genome of WSSV isolated in Korea from L. vannamei was determined to find any genetic changes. The genome was 295,884bp containing 515 ORFs of which 90 showed no sequence homology to proteins in data base.
○ For the expression of vaccine protein, polyhedrin promoter and WSSV ie1 promoter were selected and their activity were tested by fusion of the eGFP gene to the promoter and delivering the recombinant baculovirus to shrimp by immersion and feeding
○ In order to use non-replicating bacullovirus system, recombinant baculoviruses expressing the vp28 and vp19 gene were producedby using the bac-to-bac system.
○ The immunogenicity of the vaccine were assayed by producing polyclonal antibody in BALB/c mouse and testing it neutralizing activity.
○ In the vaccine trial with 6 final vaccine constructs using M. nipponense, non-vaccinated group showed 100% cumulative mortality. In contrast, vaccine treated group showed 10.2-33% cumulative mortality. Especially, a vaccine, Ac-VP28-ie1VP19+STF2, containing the WSSV VP28, VP19 genes and a flagellin gene of Salmonella was most effective.
○ Ac-VP28-ie1VP19+STF2 vaacine that was most effective vaccine in the trial with M. nipponense was tested using L. vannamei and showed 22% cumulative mortality compared to 100% cumulative mortality in the non-vaccinated group.
○ The selected Ac-VP28-ie1VP19+STF2 vaccine was produced by amplifying the virus in the SF9 cell and concentrating by ultracentrifugation. Roller bottle system was applied for the mass production of the recombinant baculovirus vaccine.
○ Atrial vaccine product named as “AVIS’ was produced and showed 10% cumulative mortality in the trail with L. vannamei.
○ Also, products with 1/10 concentration of ‘AVIS’ and another vaccine made with vaccine made by BEI inactivation showed 20% and 15% cumulative mortality, respectively.