초록 ▼

연구의 목적 및 내용
현재 널리 사용되는 방법인 혈액 단백질의 LC-MS/MS analysis를 통한 tissue specific cancer biomarker discovery는 어려움이 많다. 이러한 어려움을 고려했을 때 tissue로부터 직접적인 바이오마커를 찾는 것이 cancer의 종류에 따른 tissue/organ specific한 biomarker를 찾는데 용이할 것으로 생각된다. 따라서 기존의 연구 방향이었던 혈액 내에서의 바이오마커의 발굴에서 tissue specific한 바이오 마커 발굴의 어려움으로 인해 새로

연구의 목적 및 내용
현재 널리 사용되는 방법인 혈액 단백질의 LC-MS/MS analysis를 통한 tissue specific cancer biomarker discovery는 어려움이 많다. 이러한 어려움을 고려했을 때 tissue로부터 직접적인 바이오마커를 찾는 것이 cancer의 종류에 따른 tissue/organ specific한 biomarker를 찾는데 용이할 것으로 생각된다. 따라서 기존의 연구 방향이었던 혈액 내에서의 바이오마커의 발굴에서 tissue specific한 바이오 마커 발굴의 어려움으로 인해 새로운 전략으로 폐암환자의 조직에서 Primary culture를 통한 secreted protein을 collection 하여 이로부터 폐조직에 특이적인 바이오마커 후보를 찾기고 이를 검증하는 연구를 진행한다. 또한 발굴된 바이오마커 후보의 단백질로서의 기능에 대한 기존의 알려진 보고들을 바탕으로 폐암의 진행과 경과에 있어서 단백질의 역할을 규명하고 이를 in vitro study와 mouse in vivo model을 이용하여 증명하는 것이 본 연구의 내용이다.

연구결과
최종목표: 폐암 조직을 배양한 secretome을 프로테오믹스 기법을 이용하여 폐암 바이오마커를 발굴하고 확인, 검증함.
1차년도: 폐암조직을 배양한 후 배양액으로 부터의 분비 단백질의 선별
о 실제 환자로부터의 폐조직에서 세포를 분리, 초대배양을 실시하고 배양액을 TCA precipitation을 거쳐 단백질 농축함.
о 프로테오믹스 기법을 통한 폐조직 secretome 분석함.
о 스크리닝을 통해 여러 단백질 가운데 타겟 후보 하나를 최종적으로 선별함.
2차년도: 선별 된 폐암 바이오마커 후보의 small scale verification 과 valdation을 위한 set up
о Western blot analysis를 통해 small scale의 verification이 진행됨. 최종적으로 62 human case에서 검증을 완료함.
о lung specificity확인으 위한 IHC analysis를 통한 타 암과의 비교검증함.
о Proof-of-concept 실험을 통한 폐암 상황에서의 QSOX1 단백질 발현의 증가 검증함.
о 혈액에서의 검증을 위한 ELISA development나 Mass spectrometry based quantification (MRM) set up을 위한 예비 실험 실시함.
3차년도: 선별 된 암 바이오마커 후보의 validation 과 functional assays
о MRM 방법을 통한 형액에서의 QSOX1의 검증을 실시함.
о ELISA development를 위한 단클론 항체 제작을 실시함
о 세포주를 활용한 in vitro 실험을 통하여 QSOX1이 폐암의 증식과 전이에 관여할 것이라는 결과를 도출함.

연구결과의 활용계획
지금까지 secretome 혹은 secreted protein에 대한 연구는 상당 부분은 cell line에서 진행되어 보고되어왔다. 이러한 부분에서 primary 세포를 이용한 바이오마커의 발굴과정을 통해 신규한 폐암 후보군을 얻을 수 있을 것으로 예상한다. 또한 암세포에서 직접적으로 분비되거나 암세포 주변의 면역세포에서 분비되는 단백질이 대부분 이므로 이들이 직접적으로 암의 전이나 진행 기전에 작용할 가능성이 높으므로 앞으로의 치료 표적 단백질로서의 가치를 가질 가능성도 존재한다.
바이오마커의 발굴이 완료되고 어느 정도 검증이 된 후 가장 활용성이 높은 분야는 암 진단 분야로서 현재까지 보고된 바이오마커들 보다 높은 specificity를 나타낼 가능성이 높고 따라서 이러한 부분에서 상호 보완적으로 사용될 경우 폐암 진단에 바이오마커의 활용에 있어서 그 가치가 높을 것으로 예상된다.

Abstract ▼

Purpose&contents
Biomarker study in serum pro teins has many limitations for the tissue specific biomarker discovery. For the tissue/organ specific biomarker discovery, it would be needed to study tissue derived proteins. Therfore, in this study with new strategy, searching biomarkers in the secr

Purpose&contents
Biomarker study in serum pro teins has many limitations for the tissue specific biomarker discovery. For the tissue/organ specific biomarker discovery, it would be needed to study tissue derived proteins. Therfore, in this study with new strategy, searching biomarkers in the secrretome of primary cultured cells, lung cancer tissue specific biomarker discovery will be conducted. The selected biomarker will be verified and validated in clinical samples. In addition, the functions of bimarker in lung cancer proliferation or migration/invasion will be further studied in vitro and in vivo models.

Result
Final Goal: Discover lung cancer biomarker from analysis of secretomes of primary cultured lung cancer cells amd verify and validate biomarkers.
1st year: Selection of lung cancer biomarker candidiats from proteomic analysis of secretomes of primary culutred lung cancer cells
о Isolation of lung cancer and adjacent nornal lung cells from lung cancer patients and collection of secreted proteins from conditioned media.
о Proteomic analysis of TCA precipitated secreted proteins
о Selection of biomarker candidate via small scale screening
2차년도: small scale verification of selected biomarker and establish methodology for valdation
о Small scale verification via Western blot analysis on 62 human lung cancer cases
о Immunohistochemical analysis on TMA for lung specificity confirmation
о As Proof-of-concept experiments, QSOX1 expression pattern has been confirmed in LLC mouse model
о Pilot test for the validation methods establishment; ELISA development and Mass spectrometry based quantification (MRM)
3차년도: Validation of QSOX1 in serum and functional assays
о Validate QSOX1 protein level in the serum via MRM
о Monoclonal antibody prduction for the ELISA development
о In vitro test with shRNA knock-downed cells, it is suggested that QSOX1 might be involved in migration and invasion in cancer metastasis

Expected Contribution
So far, most secretome study has been conducted on cell lines. Study results of primary cultured lung cancer cells might provide new, novel biomarker candidates. In addition, most tissue derived proteins are directly secreted from cancer cells themselves or from immune cells interacting with cancer cells, therefore; it has high possibility that such proteins would be targets for cancer therapy.
The most applicable field of biomarkers is diagnosis of cancers. Tissue derived biomarkers would show higher specificity than serum biomarkers. It is suggested that combination of serum biomarkers and tissue secretome derived biomarkers would show better sensitivity and specificity with better clinical applicability.