초록 ▼

연구의 목적 및 내용
심각한 감염성 질환인 결핵의 원인균은 외부환경의 변화를 인식하여 생존할 수 있도록 유전자의 발현을 조절하는데 two-component system을 사용한다. 본 연구에서 결핵균의 two-component system을 구성하는 sensor kinase와 response regulator의 상호작용과 신호전달 기작을 단백질 분자의 입체구조 분석을 통해 원자수준에서 밝힘으로서 이들 두 단계 신호전달 시스템 단백질을 제어할 수 있는 조절 약물의 정확한 표적을 제공하여 이를 바탕으로 한 결핵치료제 개발에 도움을

연구의 목적 및 내용
심각한 감염성 질환인 결핵의 원인균은 외부환경의 변화를 인식하여 생존할 수 있도록 유전자의 발현을 조절하는데 two-component system을 사용한다. 본 연구에서 결핵균의 two-component system을 구성하는 sensor kinase와 response regulator의 상호작용과 신호전달 기작을 단백질 분자의 입체구조 분석을 통해 원자수준에서 밝힘으로서 이들 두 단계 신호전달 시스템 단백질을 제어할 수 있는 조절 약물의 정확한 표적을 제공하여 이를 바탕으로 한 결핵치료제 개발에 도움을 주고자 하였다. 현재까지 결핵균의 two-component system에 대한 구조 분석를 규명하고 분석하였으며 축적된 histidine kinase와 response regulator에 대한 분자구조를 바탕으로 자세한 작동 메커니즘과 상호 작용에 대한 연구결과를 얻었다.

연구결과
현재까지의 연구결과는 ① 결핵균에 존재하는 12가지 two-component system을 구성하는 13가지 histidien kinase와 12가지 response regulator 그리고 6가지 orphan 신호전달시스템 단백질의 유전자를 분석하고 ② Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain으로 부터 전체와 주요 도메인 유전자를 클로닝하여 총 104개의 construct를 제작하고 이중 97개에 대해 단백질의 발현 및 정제를 실시하였다. ③ 정제된 단백질의 결정체 스크리닝으로 11개 단백질에 대한 결정체를 획득하였으며 ④ MtrA, DosS, DosT의 주요 도메인의 입체구조를 규명하였다. ⑤ Histidine kinase의 구조 분석결과 ATP 결합을 위한 형태전환과 trans-autophosphorylation, N-말단 도메인에 의한 sensor core의 신호를 kinase 도메인으로 전달하는 메커니즘 등을 밝혔으며 ⑥ Histidine kinase와 response regulator의 상호작용으로 DosS와 NarL간의 cross-talk을 밝혀냈다. ⑦ Isothermal titration calorimetry를 통해 상호작용하는 histidine kinase와 response regulator의 결합력을 평가하였으며 ⑧ Response regulator의 특정 아미노산에 의해 인산화를 유지하는 시간에 결정되는 활성변화와 ⑨ Histidine kinase에 의한 response regulator의 인산화와 탈인산화에 조절관계가 있다는 것을 밝혔다.

연구결과의 활용계획
결핵균의 two-component system을 구성하는 단백질간의 신호전달을 제어할 수 있는 원자수준에서의 연구결과는 이들의 활성을 억제하는 약물의 개발에 있어 구체적인 표적을 제공하며, 제어에 적용할 약물이 바로 결핵치료제의 선구물질이 될 수 있어 구조 기반 약물설계와 약물 스크리닝을 통한 새로운 결핵치료제 개발에 박차를 가할 수 있을 것이다. 또한 결핵균의 감염과 체내에서의 생장, 잠복상태로의 전환에 필요한 신호전달체계에 대한 더욱 상세한 정보를 얻을 수 있어 새로운 결핵치료제의 개발이 가능할 뿐만 아니라 세균의 신호인지 분야의 연구에서 최고 수준의 경쟁력을 확보하게 될 것이다.

Abstract ▼

Purpose & contents
Mycobacterium tuberculosis causing a serious infectious disease, tuberculosis can survive against environmental changes by expressing the essential genes for survival through two-component systems consisted of sensor kinases and response regulators. The sensor kinases and respo

Purpose & contents
Mycobacterium tuberculosis causing a serious infectious disease, tuberculosis can survive against environmental changes by expressing the essential genes for survival through two-component systems consisted of sensor kinases and response regulators. The sensor kinases and response regulators in these systems are good candidates for new drug targets since these kinds of proteins do not exist in eukaryotes. This research was a study for the specificity and signalling mechanism of the sensor kinases and response regulators in M. tuberculosis . We determined the molecular structures and the enzymatic activities of these proteins and their mutants, and the relationship between the proteins in the two-component systems. It provide a basis for the development of a new drug for tuberculosis treatment.

Result
We ① analyzed genes coding proteins consisting twelve two-component system in M. tuberculosis including 13 histidine kinases, 12 response regulators, and 6 orphan proteins; ② cloned the genes from M. tuberculosis H37Rv strain and made 104 expression constructs for the full-length and domains of the proteins; expressed 97 constructs and purified the proteins; ③ obtained 20 kinds of protein crystals with the proteins; ④ determined and analyze the three-dimensional structures of MtrA, NarS, DosS, DosT, NarR. and DosR domains; ⑤ revealed the mechanism of signal transduction including conformational changes for ATP binding, trans-autophosphorylation, suppression of activity by a part of sensor core; ⑥ discovered a cross-talk between DosS and NarL among the histidine kinases and response regulators; ⑦ estimated binding affinity of the proteins by isothermal titration calorimetry; ⑧ found how to turn off the activated response regulator; ⑨ showed histidine kinases are responsible for both phosphorylation and dephosphorylation of response regulators.

Expected Contribution
We will understand a detailed signal transduction in M. tuberculosis for environmental changes during infection and in macrophages partly because the molecular structures and relationships between sensor kinases and response regulators in different two-component systems are revealed in the molecular level. The successful accomplishment of this study not only will extend the knowledge about the two-component system, but also will contribute to the enhancement of human welfare by developing anti-tuberculosis agents. The molecular structures of these proteins can be used directly for the structure-based drug discovery.

목차 Contents

• 핵심연구사업 최종보고서(평가용) ... 1
• 목 차 ... 3
• 연구계획 요약문 ... 4
• 연구결과 요약문 ... 5
• 한글요약문 ... 5
• SUMMARY ... 6
• 연구내용 및 결과 ... 7
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
• 4. 목표달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 69
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 71
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 72
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 72
• 8. 참고문헌 ... 73
• 9. 연구성과 ... 73
• 10. 기타사항 ... 74
• 끝페이지 ... 80