초록 ▼

본 연구의 1 및 2차년도에서 결핵균 감염 대식세포에 대한 유전체 분석결과 발굴된 대식세포
유래 특이 유전자에 대한 기능 연구를 수행한다. 병원성 표준균주에 감염된 대식세포에서 발
현되는 초기 유전자군 중 결핵면역병인과 관련이 깊을 것으로 생각되는 IL-8, thioredoxin
reductase 등 소수의 유전자를 대상으로 사람 대식세포에 대한 결핵균의 기능 연구를 수행한
다. 한편 1 및 2차년도의 연구결과를 기반으로 폐결핵 난치군 및 재치료군의 특징적인 세포
면역반응의 신호전달체계 분석 및 분자면역학

본 연구의 1 및 2차년도에서 결핵균 감염 대식세포에 대한 유전체 분석결과 발굴된 대식세포
유래 특이 유전자에 대한 기능 연구를 수행한다. 병원성 표준균주에 감염된 대식세포에서 발
현되는 초기 유전자군 중 결핵면역병인과 관련이 깊을 것으로 생각되는 IL-8, thioredoxin
reductase 등 소수의 유전자를 대상으로 사람 대식세포에 대한 결핵균의 기능 연구를 수행한
다. 한편 1 및 2차년도의 연구결과를 기반으로 폐결핵 난치군 및 재치료군의 특징적인 세포
면역반응의 신호전달체계 분석 및 분자면역학적 기작에 대한 연구를 수행한다. 대식세포의 결
핵항원에 대한 면역반응에서 IFN-&\nu& 혹은 TNF-&\alpha&와 같은 사이토카인 및 각종 stimulant의
TNF-&\alpha& 및 nitric oxide 활성과정의 신호전달 기작을 분석한다. 특히 toll-like receptor (TLR)
를 통한 신호전달과정 중 IkappaB kinase (IKK)-NF-&\kappa&B 경로와 mitogen-activated protein
kinase (MAPK) 경로 즉, p38 MAPK, extracellular-signal regulated kinase (ERK) 1/2,
c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 경로를 집중적으로 탐구한다.
건강인 단핵세포 및 U937 세포주를 이용하여 폐결핵의 원인균인 M. tuberculosis H37Rv (M.
tbc)와 M. marinum, 백신균주인 M. bovis BCG, M. smegmatis, 및 비병원성 M.
tuberculosis H37Ra로 감염시킨 후 ELISA 방법을 이용하여 생성된 IL-8을 조사하였으며 동
일한 조건에서 I&\kappa&B&\alpha&의 분해정도를 western blot으로 분석하였다. 또한 널리 이용되고 있는
PPD 항원 및 결핵균 배양액으로부터 분리한 30-kDa 항원으로 건강인 튜베르쿨린 양성자 13
명 및 폐결핵 환자 (초치료군 15 명, 치료실패군 21 명 및 다제내성군 13 명)의 말초혈액 림
프구를 in vitro에서 18 혹은 96 시간 동안 자극한 후 ① IFN-&\nu&, TNF-&\alpha&, IL-8 및 MCP-1의
생성을 ELISA에 의하여 측정하였으며 ② 재조합 사람 IFN-&\nu& 혹은 항 IL-10 중화항체를 이
용하여 감소된 TNF-&\alpha&의 생성 조절을 분석하고 ③ IFN-&\nu& 혹은 TNF-&\alpha&에 의한 IL-8 및
MCP-1 생성의 조절을 탐구하였으며 ④ 건강인 단핵세포를 분리한 후 western analysis 및
MAPK와 PTK 경로에 대한 특이억제제를 이용하여 TNF-&\alpha& 생성 조절 기작을 탐구하였다.
IL-8 유전자 및 단백질 발현은 M. marinum 균주로 감염시킨 경우가 다른 결핵균주으로 감
염시킨 경우에 비해 유의하게 낮았으며 M. tbc로 감염시켰을 때 생성된 IL-8은 다른 결핵균
으로 감염시킨 경우에 비해 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한 건강인 단핵세포에 대하여
위에서와 동일한 방법으로 결핵균을 처리한 후 생성된 IL-8을 비교했을 때 U937세포주의 경
우와 유사한 결과를 얻었다. M. tbc와 M. marinum로 1 시간 동안 감염시킨 후 U937세포의 I
&\kappa&B&\alpha&의 분해정도를 western blot으로 확인한 결과 M. tbc로 감염시킨 경우 M. marinum 감염
에 비해 시킨 경우에 비해 I&\kappa&B&\alpha&의 발현도가 매우 약화되어 있어서 M. tbc에 의해 IκB&\alpha&의 분
해가 강하게 유도됨을 알 수 있었다. 다제내성군의 IFN-&\nu&, TNF-&\alpha&, IL-8 및 MCP-1 생성능을
초치료군, 치료실패군 및 건강인 대조군과 비교한 결과 다제내성군을 포함한 폐결핵 환자군의
PPD 및 30-kDa 항원에 의한 IFN-&\nu& 생성은 건강인 대조군에 비해 유의하게 감소되어 있었
고, 다제내성군은 특히 30-kDa 항원에 의한 TNF-&\alpha&의 생성이 매우 특이적으로 감소되어 있
었다. 초치료군의 말초혈액 단핵구 유래 IL-8은 매우 유의하게 증가되어 있었으나 MCP-1은
오히려 감소된 양상이었다. 감소된 TNF-&\alpha&의 생성에 대한 IFN-&\nu& 혹은 IL-10의 영향을 조사
한 결과 재조합 사람 IFN-&\nu&의 전처리는 PPD 항원에 의한 말초혈액 단핵구의 TNF-&\alpha& 생성에
영향을 주지 못하였으나 항 IL-10 항체에 의한 TNF-&\alpha&의 생성은 유의하게 감소되었다. 또한
재조합 사람 TNF-&\alpha& 혹은 IFN-&\nu&, 그리고 항 TNF-&\alpha& 항체 혹은 항 IFN-&\nu& 항체의 단독 혹은
병합 처리에 의한 IL-8과 MCP-1 생성을 조사한 결과 각각 TNF-&\alpha&와 IFN-&\nu&에 의해 IL-8 및
MCP-1 생성이 유의하게 증가 혹은 감소됨을 알 수 있었다. 사람 말초혈액 단핵세포에 대한
30-kDa 항원 자극 후 TNF-&\alpha& 생성 기작을 분석하고자 ERK 및 p38 kinase 인산화 항체를 이
용하여 western blot analysis를 수행한 결과 30-kDa 항원 자극 후 5분 내지 10분에 매우 빠
른 인산화가 일어나는 것을 확인하였다. 또한 p38 kinase 경로의 억제제인 SB203580과 ERK
경로의 억제제인 U0126 및 PD98059를 이용하여 p38 및 ERK 두 경로 모두 30-kDa 항원에
의한 TNF-&\alpha& 생성에서 매우 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

Abstract ▼

Although tuberculosis remains the greatest cause of death due to a single pathogen worldwide,
little is known about the immunopathogenesis of Mycobacterium tuberculosis (M. tbc) with
interactions with host immune cells. The first objective of this study was to investigate
possible factors i

Although tuberculosis remains the greatest cause of death due to a single pathogen worldwide,
little is known about the immunopathogenesis of Mycobacterium tuberculosis (M. tbc) with
interactions with host immune cells. The first objective of this study was to investigate
possible factors in the host macrophages for determining differential pathologic responses to M.
tbc and M. marinum using an in vitro model of mycobacterial infection. Second, we were to
determine the macrophage-derived factors related to the immunopathogenesis or protective
immunity via studying immunologic responses of the human cytokine and costimulatory
molecule expressions to the mycobacterial protein in an ex vivo system.
We studied differential gene expression profiles in M. tbc and M. marinum-infected human
monocytic cells. Using SSH, we identified 12 differentially expressed cDNA clones. Expression of
IL-8 mRNA and protein was stronger in M. tbc-infected cells than in cells infected with M.
marinum. IL-8 depression was found only in M. marinum-infected U937 cells and human
monocytes when compared with cells infected with M. tbc H37Ra, M. bovis BCG or M.
smegmatis. In addition, the immunologic profiles of mycobacterial proteins were screened in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and monocyte-derived macrophages (MDM) from
tuberculosis patients with various clinical manifestations (early, re-treatment, treatment-failure,
re-activation, and multidrug-resistant) and normal controls by examining Th1, proinflammatory
cytokine and chemokine production (IFN-&/nu&, TNF-&/alpha&, IL-8 and MCP-1) of peripheral blood
mononuclear cells. Then, we analyzed the intracellular signaling pathways that are activated in
30-kDa antigen (Ag)-induced human monocytes. We examined whether the activation of the p38
kinase pathway was responsible for 30-kDa Ag-induced TNF-&/alpha& production in human monocytes.
ELISA assay showed that IL-8 protein secretion was significantly elevated in M. tbc-infected
U937 cells, human primary monocytes and monocyte-derived macrophages as compared with M.
marinum-infected cells. The depressed IL-8 expression was unique in M. marinum-infected
cells as compared with cells infected with other strains of mycobacteria, including M. tbc
H37Ra, M. bovis BCG or M. smegmatis. When the expression of nuclear factor-&/kapaa&B (NF-&/kapaa&B)
was assessed in mycobacteria-infected U937 cells, I&/kapaa&B&/alpha& proteins were significantly degraded in
M. tbc-infected cells as compared with M. marinum-infected cells. The most significantly
depressed TNF-&/alpha& levels were found in PBMC from patients with MDR-TB after stimulation
with the 30-kDa for 18 h, when compared with those from other groups of TB patients and
HTR. TNF-&/alpha& secretion in response to the 30-kDa Ag was unchanged by co-culturing with
recombinant human interferon (rhIFN)-&/nu&, and was increased dramatically following IL-10
neutralization with an anti-human IL-10 antibody. The rhIFN-&/nu& and rhTNF-&/alpha& directly caused
an increased MCP-1 and IL-8 secretion by 30-kDa stimulated PBMC, respectively. When
human monocytes were stimulated with the 30-kDa Ag of M. tbc, we found significant
increases of TNF-&/alpha& and IL-10 secretions in human monocytes. Analysis of ERK and p38 kinase
showed a rapid phosphorylation of both subfamilies in monocytes in response to the 30-kDa
Ag. Using highly specific inhibitors of p38 (SB203580) and MAPK kinase-1 (U0126 and
PD98059), we found that activation of both p38 and ERK was essential for 30-kDa Ag-induced
TNF-&/alpha& production. Collectively, these results suggest that differential IL-8 expression between
human macrophages infected with M. tbc and M. marinum may be critically associated with
distinct host responses in tuberculosis. Additionally, these data suggest that the PBMC of
MDR-TB patients typically show TNF-&/alpha& depression in response to the 30-kDa Ag, and this
effect is modulated by IL-10. Furthermore, we set out to elucidate the role of ERK 1/2 and p38
MAPK activation in the TNF-&/alpha& response of 30-kDa Ag-infected human monocytes.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문...4
• 1. 국문요약문 ...4
• Ⅱ. 연구결과 요약문...5
• 1. 국문요약문 ...5
• 2. 영문요약문 ...6
• Ⅲ. 연구내용...7
• 1. 서론...7
• 2. 연구방법 및 이론 ...10
• 3. 결과 및 고찰, 결론...15
• 4. 인용문헌...21