초록 ▼

연구 결과
필요성 및 목표
○ 양돈농가 돼지의 분변에서 존재 할 수 있는 노로바이러스 (Human, Porcine(돼지) 노로바이러스)의 분리를 통해 2종 바이러스의 유전적 유사성 분석을 통한 인수공통병원체로서 가능성 분석 필요
○ 돼지에서 노로바이러스에 대한 유전적 특성분석을 다양한 분석법(유전자 증폭, 염기서열분석, PMA, EMA, ELISA, 전자현미경, 유전자정량) 접근을 통해 Porcine 노로바이러스와 Human 노로바이러스의 유전적 상관특성 분석
○ 돼지 노로바이러스 PCR 검출과정에 검사과정의

연구 결과
필요성 및 목표
○ 양돈농가 돼지의 분변에서 존재 할 수 있는 노로바이러스 (Human, Porcine(돼지) 노로바이러스)의 분리를 통해 2종 바이러스의 유전적 유사성 분석을 통한 인수공통병원체로서 가능성 분석 필요
○ 돼지에서 노로바이러스에 대한 유전적 특성분석을 다양한 분석법(유전자 증폭, 염기서열분석, PMA, EMA, ELISA, 전자현미경, 유전자정량) 접근을 통해 Porcine 노로바이러스와 Human 노로바이러스의 유전적 상관특성 분석
○ 돼지 노로바이러스 PCR 검출과정에 검사과정의 객관성 향상에 필요한 유전자 검출용 양성대조군 개발

방 법 및 결 과
[방법]
○ 전국 총 13개 축산 돼지농가로부터 돼지분변 402건과 환경 시료 4건 총 406건 시료 수집 후 국내ㆍ외에서 사람 노로바이러스, 돼지 노로바이러스 및 돼지 사포바이러스 유전자 증폭에 사용하는 Conventional RT-PCR과 Realtime RT-PCR 총 11개 검출법 선별하여 검출감도가 높은 최적 방법을 선택. Conventional RT-PCR 증폭과 염기서열분석을 통해 genotyping 및 Reference와의 상동성 분석하고 Realtime RT-PCR 검출 유전자의 정량특성을 연구
○ 돼지 분변으로부터 분리된 노로바이러스에 대한 생존성을 간접적으로 측정하기 위해 분자생물학 기법 PMA(Propidium monoazide), EMA(Ethidium monoazide)를 이용한 바이러스의 생존성 구분
○ 유전자 증폭과 염기서열분석을 통해 분리된 노로바이러스에 대한 항원ㆍ항체 결합(ELISA) 분석 및 투사 전자현민경 관찰(TEM)
○ 돼지 노로바이러스 Conventional RT-PCR 검출에 필요한 양성 대조군 제작을 위해 인위적 gene 합성기법 이용
[결과]
○ 돼지 분변에서 Human-like 노로바이러스 G1-10 type 0.49%(2/402), GII-4 type 0.49%(2/402) PCR을 통해 1차 스크린 되었으나 4건 모두 생존성이 확인되지 않음
○ GI-10(Human-like 노로바이러스), GII-11 type(Porcine 노로바이러스) 투사현미경 관찰 결과 32nm 지름의 노로바이러스 형태 확인
○ Human-like 노로바이러스로 분리된 4건 시료의 생존성 간접평가 (PMAㆍEMA)에서는 모두 생존성이 확인되지 않음
○ Porcine노로바이러스는13.6%(55/402)가분리. 모두육성돈에서분리되었으며 Porcine 사포바이러스는 22.3%(90/402)로 이유돈에서로 가장 높게 검출
○ Porcine 노로바이러스는 육성돈에서 가장 높은 검출율을 보였으며 Porcine 사포바이러스는 이유돈에서 검출율이 높아 각기 다른 연령대에서 유행하고 있음
○ 동일한 돼지 분변에서 human-like 노로바이러스 이외의 Porcine 노로 바이러스와 Porcine 사포바이러스가 동시에 검출되지 않음
○ Porcine 노로바이러스 GII-11의 유전자 정량적 최대 값은 0.5 x 10⁷ copies/g로 분석
○ Porcine 노로바이러스, Porcine 사포바이러스 유전자 검출용 PCR 양성 대조군 제작 개발

기대성과
○ 돼지 분변에서 Human 노로바이러스 검출 확인을 통한 국내분포 현황자료 확보 및 노로바이러스 동물 감염모델 개발 연계
○ 돼지 분변에서 노로바이러스 검출방법을 위한 다양한 기술에 대한 평가 및 정립

Abstract ▼

1. Genetic analysis of Porcine norovirus in livestock environment
Fecal samples from 402 porcine and 4 environment were examined. The age of the porcine was <4 week to > 12 month. The RT-PCR methods previously designed for the detection of HuNoVs and Porcine NoVs was performed using the previousl

1. Genetic analysis of Porcine norovirus in livestock environment
Fecal samples from 402 porcine and 4 environment were examined. The age of the porcine was <4 week to > 12 month. The RT-PCR methods previously designed for the detection of HuNoVs and Porcine NoVs was performed using the previously published primers.
Fifty-five(13.6%) of 402 samples were positive for the Porcine NoV, and 90(22.4%) of 402 samples were positive for Porcine sapovirus. To quantify the NoV capsid gene in these samples of under Porcine NoVs, we performed realtime RT-PCR using standard RNA. The result showed that the number of copies by realtime RT-PCR was 0.5 x 10⁷ copies/g. Theses results was not the highest genetic similarity of HuNoVs and Porcine NoVs.
2. Evaluation of NoV survival using molecular methods
To survival testing of Porcine NoV and Human-like NoV from porcine fecal, we used PMA(Propidium monoazide) assay and EMA(Ethidium monoazide) assay. Porcine NoVs expoesd heat stress and conducted EMA/PMA realtime RT-PCR. Evaluation result of survivability test of porcine NoVs between heating a samples and no heating samples were a difference of realtime RT-PCR Ct 3～4 value. Therefore, we measured Porcine NoVs viability through heating treatment. But, Human-like NoV not detected cases in the EMA/PMA realtime RT-PCR.
The result by ELISA of Porcine NoV and Human-like NoV detected cases of 11 in the PCR positive samples. ELISA value of Human-like NoV detected in 1 strain(GI-10) where NoV was detected out of 4 strain in total. Identification of virus particles of Porcine NoV and Human-like NoV was
3. Development of standardized positive control for conventional RT-PCR of Porcine NoVs
In this study, we developed the standardized positive control for the PCR detection of Porcine NoVs and Porcine Sapovirus. To produce RNA transcripts under plasmid vector, plasmids transcribed with the Max large-scale RNA production system(in vitro transcription system) with T7 polymerase. To determined whether they were suitable as positive controls, the RNA transcripts were used as templates in RT-PCR under same conditions used for real samples. When RT-PCR to detect Porcine NoV and Porcine Sapovirus were performed, the positive control reaction yielded transcripts of the expected size. These standardized products may be used divide into two groups(Porcine NoV and Human NoV) from stools of farm pigs and gnotobiotic pigs.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 4
• Summary ... 6
• 목 차 ... 9
• 그림 목록 ... 10
• 표 목록 ... 12
• 연구개발과제 연구결과 ... 14
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 제2장 연구개발과제의 국내ㆍ외 연구개발 현황 ... 24
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 방법 및 결과 ... 32
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 107
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 109
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 110
• 제7장 참고문헌 ... 111
• 끝페이지 ... 114