보고서 정보
주관연구기관 |
국립축산과학원 National Institute of Animal Science |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2015-03 |
과제시작연도 |
2014 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010356 |
과제고유번호 |
1395035549 |
사업명 |
축산시험연구 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500010356 |
초록
▼
Ⅳ. 연구개발결과
- GalT _MCP/_MCP 형질전환 돼지의 체세포 구축
- 바이러스 유래 CMV 프로모터, 닭 유래 CAG 프로모터, 사람 유래 EF1a 및 MCP 프로모터, 그리고 돼지 유래 MCP 프로모터와 enhancer로서 CMV프로모터를 사람유래 EF1a프로모터에 연결한 융합 프로모터를 각각 클로닝하여 bascic Luciferase 벡터에 삽입시킴
- 돼지의 섬유아세포에 HLA-E/beta2m 벡터를 도입시킨 후 웨스턴 블롯 분석 방법과 형광염색 방법으로 두 개
Ⅳ. 연구개발결과
- GalT _MCP/_MCP 형질전환 돼지의 체세포 구축
- 바이러스 유래 CMV 프로모터, 닭 유래 CAG 프로모터, 사람 유래 EF1a 및 MCP 프로모터, 그리고 돼지 유래 MCP 프로모터와 enhancer로서 CMV프로모터를 사람유래 EF1a프로모터에 연결한 융합 프로모터를 각각 클로닝하여 bascic Luciferase 벡터에 삽입시킴
- 돼지의 섬유아세포에 HLA-E/beta2m 벡터를 도입시킨 후 웨스턴 블롯 분석 방법과 형광염색 방법으로 두 개의 유전자 HLA-E/beta2m이 동시에 발현하는 것을 확인함.
- HLA-G와 CD47 cDNA를 각각 FMDV 2A와 furin cleavage site-FMDV 2A 염기서열이 포합된 벡터에 삽입하여 HLA-G/F2A-CD47 벡터와 HLA-G/ F-F2A-CD47 벡터를 제작함
- HLA-G/CD47 동시 발현 벡터를 도입한 후 neomycin을 사용하여 선별을 실시함. 총 11개의 클론을 확보하여 PCR 방법으로 분석한 결과 3개의 클론에서 HLA-G/CD47 동시 발현 벡터가 삽입된 것을 확인함.
- 하나의 mRNA로부터 다중의 단백질 발현을 가능케 하는 4종의 바이러스 유래 P2A, T2A, E2A, F2A peptide 염기서열을 클로닝하였고, 각각의 2A peptide 염기서열 사이에 multiple cloning site를 첨가한 다중 유전자 발현용 근간(backbone) 벡터 제작함.
- 다중 유전자 발현용 근간(backbone) 벡터의 multiple cloning site를 이용하여 HLA-E, b2m, HLA-G, CD47, CD73을 삽입하였고, 5개의 유전자를 동시에 발현 시길 수 있는 프로모터는 Ef1a 발현벡터 앞쪽에 삽입하여 5개 유전자 동시 발현 벡터를 제작함
- 돼지에서 목표 유전자의 효율적 발현을 조절할 수 있는 돼지의 엑틴 프로모터, Ef1a 프로모터, 엑틴 + 돼지 Ef1a 프로모터, 돼지 엑틴 + 사람 Ef1a 프로모터를 개발
- 돼지 Ef1a프로모터와 돼지 actin/Ef1a 융합 프로모터에 각각 4개 유전자 발현 벡터 2종을 완성하여 돼지 Ef1a프로모터에 4개 유전자 발현벡터를 연결한 벡터를 GalT – MCP/-MCP 형질전환 돼지의 섬유아세포에 도입함
- GalT KO -/+ 간 또는 -/- 와의 교배를 통하여 이종장기 이식에 사용이 가능한 GalT -/- 돼지를 11두 생산
- 자연교미 방법을 통하여 초급성 및 급성 면역유전자인 GalT KO(-/+) / hCD46 KI 된 형질전환 돼지 12두를 생산하였으며, 이들 간의 교배를 실시하여 GalT KO(-/-) / hCD46 KI 1두를 생산
- 일반 배양액에서 발달시킨 복제난자의 경우 fragmentation이 일어난 난자는 23.2%로써 6.9% 정도로만 fragmentation이 일어난 줄기세포 배양액을 사용한 처리군에 비하여 매우 높게 일어난다는 것을 확인
- 처녀생식(parthenotes) 난자의 평균 이식 난자수는 204개였으며 4마리의 대리모에 이식한 결과 2마리에서 임신이 확인이 되었다. 또한 국립축산과학원(NIAS)에서 구축한 형질전환 체세포를 이용한 처리군은 평균 이식 난자수가 64±23개였으며, 총 17두의 대리모에 이식을 실시하여 11두에서 임신이 확인
- 임신 35일령에 회수한 태아의 크기와 체중을 측정한 결과, 일반돼지의 경우 임신 35일째 태아의 크기는 평균 4cm, 체중이 약 3.7g 정도인 반면 복제난자 유래 태아의 경우 1.65cm와 3.7g로 확인
- 배양후의 줄기세포 배양액(SCCM: stem cell conditioned medium)을 25% 첨가하여 체외성숙시킨 처리군에서는 대조군에 비하여 유의적으로 높은 돼지 난자의 체외 성숙율을 확인
- 25%의 줄기세포 배양액 SCCM을 사용하여 난자와 수정란을 배양한 결과 돼조군보다 체외성숙 및 배반포 발달 모두에서 유의적으로 높은 효과를 나타냄
- 회수된 태아의 크기를 비교한 결과 단위발생 유래 태아의 경우 일반돼지 태아보다 이식 후 26일째와 35일째 모두에서 유의적으로 크기가 작은 것으로 확인
- 단위발생 난자 유래 태아(parthenotes)와 인공수정 유래 일반돼지 태아(AI)에서 IGF2 유전자의 methylation 패턴을 확인한 결과 차이가 나타나지 않음
- 단위발생 난자 유래 태아에서 H19 유전자의 methylation이 인공수정 유래 일반돼지 태아보다 극단적으로 감소하는 것을 확인
Abstract
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Pig organs are seriously considered by many researchers for clinical xenotrans-plantation for human patients suffering from organ failure. However, obstacles that occur by immunological and/or physiological incompatibilities between pig and human should be overcome to increase potential of clinical
Pig organs are seriously considered by many researchers for clinical xenotrans-plantation for human patients suffering from organ failure. However, obstacles that occur by immunological and/or physiological incompatibilities between pig and human should be overcome to increase potential of clinical xenotransplantation. The most profound barrier to xenotransplantation is the rejection of grafted organ by a cascade of immune mechanisms commonly referred to as hyperacute rejection (HAR), acute humoral xenograft rejection (AHXR), immune cell-mediated rejection and chronic rejection. It is well known that studying of pig-to-primates xenotrans-plantation by application with the transgenic pig lacking and/or expressing genes to prevent rejection of xeno-grafted organ would provide potential solution. The aim of this study is generation of transgenic pig to be used for xenotransplantation. A backbone vector for multiple-gene expression using four viral 2A systems was constructed. To test multiple expression, HLA-E and b2m expression vector was constructed using viral F2A system. Western blot, RT-PCR and flow cytometry analyses showed simultaneous expressions of HLA-E and b2m. Four promoters isolated from porcine actin, Ef1a, actin+Ef1a, actin+EF1a were cloned and then introduced into basic luciferase vector, respectively. Luciferase assay resulted in that porcine actin+Ef1a promoter led to highest promoter activity among four tested promoters. The cDNA fo HLA-E, b2m, HLA-G and CD47 under control of porcine actin+Ef1a promote were introduced into muli-cloning site of a backbone vector, respectively. The multiple espression vector was transfected into porcine fibroblasts of GalT–MCP/-MCP pig.
Eleven transgenic GalT -/- pigs were produced by natural mating between GalT KO -/+ pigs and/or between GalT KO -/+ and GalT -/- pigs. One GalT–MCP/-MCP pig was produced by natural mating between GalT–MCP/+ pigs. Nuclear-transferred embryos were cultured in stem cell medium and DMEM as control. The cleavage rate and formation rate of blastocyst were higher in embryos cultured in stem cell medium than in DMEM. Pathenote embryos and transgenic embryos were transferred into four and seventeen recipients. The number of pregnant recipient were two and eleven, respectively. Almost nuclear-transferred embryos were terminated at early stages about 30 through 60 days of pregnancy. To analysis the reason abortion of early stages of pregnancy, nuclear transferred-embryo pregnant, and artificial-insemination pregnant pigs were sacrificed at 35 days of pregnancy. The body size and weight of fetus were 1.6 cm and 4 cm, and 0.5 g and 3.7 g of pathemote-embryo pregnant, and artificial-insemination pregnant pigs, respectively, meaning procedure of nuclear transfer to embryo lead to detrimental effect to development of embryo. Expression of imprinted gene is essentially required for normal development of embryo on pregnant stage. To compare methylation pattern of imprint gene, methylation of Igf2 and H19 genes of pathenote embryos and artificial inseminated embryos of early stages of pregnancy were analyzed. Methylation rates of Igf2 gene showed no difference between pathenote embryos and artificial inseminated embryos whereas showing decreased methylation rate of H19 gene in pathenote embryos.
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