초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1) CB에 의한 M11 난자의 단위발생
단위발생을 유도하기 위하여 MII 난자의 활성화를 위하여 CB 농도 2, 3, 4 및 5ug/ml 농도에서는 CB 농도에 관게없이 활성화 후 6시간에 83-94%의 pseudo pronucleus,가 형성되었다. 단지 2 ug/ml 농도에서 1st 및 2nd pb가 10.2% 나타났다.
2) 활성화된 단위발생란의 확장배반포 발달율
CB 농도에 따른 단위발생란은 2세포기, 4세포기, 배반포로 발달되어 최종적으로, 확장배반포로의 발달율은 89.7-95.9%

Ⅳ. 연구개발결과
1) CB에 의한 M11 난자의 단위발생
단위발생을 유도하기 위하여 MII 난자의 활성화를 위하여 CB 농도 2, 3, 4 및 5ug/ml 농도에서는 CB 농도에 관게없이 활성화 후 6시간에 83-94%의 pseudo pronucleus,가 형성되었다. 단지 2 ug/ml 농도에서 1st 및 2nd pb가 10.2% 나타났다.
2) 활성화된 단위발생란의 확장배반포 발달율
CB 농도에 따른 단위발생란은 2세포기, 4세포기, 배반포로 발달되어 최종적으로, 확장배반포로의 발달율은 89.7-95.9%로 발달되었다.
3) CB 처리에 의한 체세포 복제 수정란 생산
체세포 복제 수정란의 핵치환 후 3시간에 있어서 두 개의 핵이 관찰되어졌으며, CB 농도의 처리에 따라 작은 fragment가 나타났다 (5 ug/ml), CB 처리에 의한 2nd polar body 형성율을 분석한 결과 2-5 ug/ml의 CB에 의한 결과 2 ug/ml 농도에 있어서 72.6%로 가장 낮은 pseudo-pronucleus 를 형성하였다.
4) SrCl2 처리에 의한 체세포 복제 수정란의 발달
SrCl2 7, 7.5, 10 mM 농도에서 검토결과 상실배/ 배반포 발달율은 약간 차이가 있었으나, 대리모에 이식후 착상 부위 검토결과 10mM에서 52.4%로 가장 높았으며, 또한 임신 9.5일에 태아 확인결과 5mM에서는 한 마리도 없었으나, 7.5mM에서 2마리, 10mM에서 1마리가 확인되었다
5) 체세포 복제 산자 생산
또한 SrCl2 노출시간에 따른 체세포 복제 산자의 확인한 결과 13마리가 임신하여 복제 산자 7마리를 생산하였다. 메틸레이션 억제제인 TSA 처리에 의한 체세포 복제산자 생산에 대한 결과로 5, 50 nM처리에 있어서는 산자생산은 각각 2마로 2.9, 2.2%로 나타났다
6) 단위발생 수정란 및 aggregated 수정란과 동시 이식에 의한 산자 생산
Tetraploid 수정란과 체세포 복제 수정란을 융합하여 산자생산도 3.57%로 1.16%보다 높아 효율적인 면에서 tetraploid 수정란과 융합하면 체세포 복제 산자의 효율을 증가시킬 수 가 있다는 결론이다
7) 난구세포 및 tetraploid 융합에 의하여 체세포 복제로 태어난 산자의 특성
IVF 대조구와 융합 및 체세포 복제로 태어난 태반의 무게를 비교분석한 결과는 IVF에서 8마리 평균 0.147g, 융합에 의한 태반무게는 0.215g 이었고, 체세포 복제 태반무게는 26마리 평균 0.287g으로 체세포 복제에서 증가되어진 태반무게가 tetraploid 융합으로 인하여 상당히 낮아 졌다.
8) SCNT와 aggregated SCNT 및 대조구 태반에서의 microarray 분석결과
각각의 그룹에서 microarray 분석결과 대조구와 SCNT에서의 발현차이는 확실하게 패턴이 다르다는 것을 알수 있다. 또한, 벤 다이어그램 분석한 결과 발현에 있어서 up-regulation, down-regulation에서도 발현차이가 확인되었다. 33개의 imprinting 관련유전자 가운데 SCNT 그룹에서 Slc38a4 유전자는 2.32배 up-regulated 되어졌으며, lgfbp6유전자는 -3.64배로 down-regulated 되어졌다. 단지 Slc22a18은 aggregated 그룹에서 특이적으로 up-regulated 되어진 유전자이다. 나머지 6개 유전자인 Ppp1r9a, Tssc4, Ascl2, Cd81, Pon2, Slc22a2 유전자들은 생쥐와 인간에서 모체 특이적으로 발현되며 태반 specific imprinting 유전자들이다.

Abstract ▼

This study was conducted to optimize the efficiency of cloning and to produce cloned mice. The majority of cloned mammals derived by nuclear transfer (NT) die during gestation and have enlarged and dysfunctional placentas. In this study, the optimized conditions were established to produce clone mic

This study was conducted to optimize the efficiency of cloning and to produce cloned mice. The majority of cloned mammals derived by nuclear transfer (NT) die during gestation and have enlarged and dysfunctional placentas. In this study, the optimized conditions were established to produce clone mice. The parthenogenetic oocytes were activated after 6 h regardless of cytochalasin B (CB) concentration. CB treatment (2 μg/ml) was found second polar body. Lower concentration of CB was decreased the activation rate, but the second polar body was the best highly increased during 6 h incubation. The small fragments were exhibited in the 5 μg/ml treatment of CB, but it was not found in lower concentration groups (> 2.5 μg/ml). To examine effects of SrCl2 on the adult cumulus cells, somatic cell NT oocytes were exposed during 0.5, 1 and 6 hrs. The second polar body was significantly greater in 0.5 h exposure group (6.6%) than 1, 6 hrs. Developmental rate from 2-cell to 4-cell was the lowest in 7.5 mM Strontium chloride (SrCl2) groups (84.1% and 64.3%) than 5, 10 mM SrCl2. The implantation rate was not significantly difference among 5, 7.5 and 10 mM SrCl2 group. Three live fetuses were produced by SCNT. SCNT placentas were remarkably heavier than IVF group (8 fetuses) (0.34, 0.34, 0.33 vs 0.14 g) compared with the placenta weight of IVF and SCNT clones.
Mouse chimeras can also successfully be produced using tetraploid host embryos. The fusion of mouse 2-cell embryos produces tetraploid embryos. We used tetraploid embryos to increase clone efficiency by aggregation with SCNT embryos of adult cumulus cells. Six hours of activation with strontium (SrCl2) was optimal for SCNT embryos. CytochalasinB (CB) concentration (5μg/ml) during enucleation was evaluated in the efficiency of implantation sites and fetus offspring. Continuous exposure to 5-50 nM trichostatin A (TSA), a histone-deacetylase inhibitor (HDACi), for 10 h is recommended for production of clone mice. We improved the rate of SCNT implantation by co-transfer of SCNT embryos with parthenogenic embryos into opposite sides of recipient uteri. Aggregated SCNTs were constructed by aggregation of SCNT embryos with tetraploid embryos to reduce epigenetic errors in the placenta. The pregnancy and implantation rates of aggregated SCNT were significantly higher than those of SCNT alone. The full-term developmental rate of aggregated embryos was also higher than that of SCNT (3.57 vs 1.16). The placental weight of SCNT clones was significantly higher than that from invitro fertilization (IVF).
However, the placenta weight of aggregated SCNT clones was nearly the same as that of embryos in the IVF group.
The placentas of SCNT only clones appeared to have the hyperplastic histology typical of mouse clones. The aggregated SCNT method was useful for significantly reducing the placental weight of cloned mice and improving the efficiency of SCNT. Mouse chimeras can also successfully be produced using tetraploid host embryos. We produced a total of 36 clone mice, including 9 heads derived from aggregated SCNT. One-half of clones derived from aggregated SCNT survived to adulthood, and 14-clones derived from SCNT grew into healthy adults. The aggregated SCNT method was useful for significantly reducing the placental weight of cloned mice and improving the efficiency of SCNT.