초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
제 1 세부 연구과제 : 도메인 조합형 인공 2개-인자 신호전달계 개발
▪ P. putida KT2440 난분해성 화합물 감지센서 기반 벡터 구축
- P.putida F1의 TodST 시스템을 P. putida KT2440에 구축하기 위하여 P. putida 발현용벡터인 pBBRBB-eGFP 벡터에 TodST의 야생형 균주의 promoter를 클로닝(pBBRBB-PtodST) 한 뒤 TodST 시스템을 삽입.
▪ P. putida KT2440 ΔmexC::PtodX::lacZ 리포터 균주 제작

Ⅳ. 연구개발결과
제 1 세부 연구과제 : 도메인 조합형 인공 2개-인자 신호전달계 개발
▪ P. putida KT2440 난분해성 화합물 감지센서 기반 벡터 구축
- P.putida F1의 TodST 시스템을 P. putida KT2440에 구축하기 위하여 P. putida 발현용벡터인 pBBRBB-eGFP 벡터에 TodST의 야생형 균주의 promoter를 클로닝(pBBRBB-PtodST) 한 뒤 TodST 시스템을 삽입.
▪ P. putida KT2440 ΔmexC::PtodX::lacZ 리포터 균주 제작난분해성 화합물을 감지센서 기반의 리포터 균주 제작하기 위해여 P. putida KT2440 유전체에 삽입하였으며 (그림 2), 추가적으로 P. putida KT2440 ΔmexC::PtodX::sfgfp 재조합균주를 제작함. 이를 평가하기 위하여 방향족 화합물 중 toluene (Sigma, U.S.A) 처리에 따른 형광 발현 비교 평가를 시행.
▪ 변이 신호전달 기구의 구동 비교 평가
- P.putida에서 유래한 TodS 감지 단백질의 구성요소 중 PAS1 domain의 시퀸스를 다른 단백질로 치환한 27종의 mutant를 2세부 연구팀에서 받아 P. putida KT2440 발현벡터에 옮긴 후 toluene, stylene, 1,2,4-TMB, o-xylene 유무에 따른 바이오센서로서의 역할을 검증.
▪ TodS 변이체 (TodS*)를 이용한 유해 방향족 화합물 검출용 인공바이오센서 구축
- Pseudomonas putida F1 TodS의 5개 도메인 (PAS1, HK1, RR1, PAS2, HK2) 중 방향족 화합물을 인지하는 PAS1 도메인에 TodS에서 TodT로 인산기를 전달하는 마지막 도메인인 HK2 도메인을 직접 연결한 단순화된 TodS 감지 단백질 변이체 (TodS*)를 제조 및 유해 방향족 화합물 검출능력을 평가.
제 2 세부 연구과제 : 외부 신호감지 센서 개발 및 특성 규명
▪ 토양 미생물 슈도모나스균 유래 toluene 감지센서 단백질인 TodS에서, 방향족 화학물질을 감지하는 PAS1 감지센서 도메인의 toluene 결합 특이적 단백질 입체구조 변화를 규명하고, 외부신호 특이적 신호전달과 단백질 구조변화의 상관관계를 생화학적 특성 분석을 확인함.
▪ TodS/TodT 신호전달체계 의존적으로 형광 기질 분해효소 활성이 유도되는 미생물 리포터균주를 제1세부팀과 협력하여 제작하고, PAS1 감지센서 기능에 중요한 아미노산 잔기들의 생화학적 특성을 엔지니어링하여 제작한 감지센서 (ePAS1)를 형질전환 하여 총 51종의 미생물 리포터균주를 확보하였음.
▪ 각각의 ePAS1 감지센서를 발현하는 리포터 균주들의 신호전달 민감도 변화를 측정하기 위해 96 well format의 high throughput in vivo 스크리닝 시스템으로 구축하였고, 이 방법은 약 1 mM 외부신호 물질이 필요하던 기존의 in vivo 선발방법에 비해 약 100배 이상의 민감도를 갖는 방법으로 개발되었음.
▪ 신기능 감지센서의 이종세포 내 도입 및 효율적 발현 조절을 위해, PAS2 도메인 구조 정보기반 제작된 총 18종의 ePAS2-TodS/TodT의 외부신호 특이적 신호전달 능력 또한 비교분석하여, PAS2 도메인 dimerization 구조가 신호전달 조절 역할을 수행함을 확인하였음.
▪ 전자현미경적 분석결과, TodS의 형태가 외부신호 결합 특이적으로 구조가 바뀌는 매우 유연한 (flexible) 단백질임을 재확인하고, 외부신호 결합 특이적 PAS1/PAS2 도메인의 구조유지 및 변화에 따른 신호전달 분자기전을 모델로 제안하였음.
▪ 상기 구조 기반 엔지니어링과 in vivo 스크리닝 방법에 의해, 제2세부과제에서는 ePAS1-I114V는 m-xylene에 대한 민감도가 2배 이상 높은 감지센서로, ePAS1-Q61R은 toluene, styrene, m-xylene, 그리고, o-xylene에 대한 민감도가 작게는 4배 크게는 수백배이상 증가된 감지센서로 최종 선발하였고, 약 0.23 – 4.6 ppm 농도의 외부 유해물질을 감지하는 신기능의 감지센서 생체부품 소재는, 제 3, 4, 5 세부연구팀들과 연계하여 이종 세포에서의 발현을 진행하고 있음.
▪ 상기 확보된 입체구조 기반 신기능 감지센서 제작 연구개발 원천기술에 대한 특허 출원 완료하였음 (10-2014-0153892).
제 3 세부 연구과제 : 유전자모듈 제어회로 기술개발
▪ 유전체기반 중금속 감지 전사 조절 인자 발굴 및 반응성 검증
- Bacillus oceanisediminis 2691 균주의 유전체 서열 정보와 Stapylococcus aureus에서 얻은 CadC 단백질 서열을 비교하여 sequence homology를 가진 CadC1945, CadC4657, CadC538, CadC551, CadC595, CadC640의 유전자 서열을 확보함.
- 확보한 6종의 CadC 단백질이 실제로 중금속에 대한 반응성을 갖는지를 알아보기 위하여 Real Time-PCR을 수행하였음. 대체적으로 카드뮴과 납에는 반응성이 있는 것으로 나타남.
▪ 전사융합을 이용한 중금속반응 유전자회로 구축
- Bacillus oceanisediminis 2691의 유전체로부터 cadC 유전자 및 유전자 조절부위(promoter, operator)와 eGFP 형광단백질을 사용한 전사융합 유전자회로를 제작하여 중금속에 대한 반 응성을 검증한결과, CadC homolog들의 중금속에 대한 반응성이 다르지만, 대체적으로 카드뮴에 대해서는 반응성이 있는 것으로 나타남. CadC1945, CadC551은 납, 카드뮴에 반응성이 있는 것으로 확인되었으며, CadC4657은 특히 카드뮴에 대한 반응성이 매우 큰 것으로 나타남. 이를 UNIST 김태성교수팀과 공동으로 Microfluidic platform에 적용시켜 중금속감지능이 뛰어난 센서개발에 관한 연구논문 게재함 (Kim M, et al., 2015, Biosensors and Bioelectronics, 65:257-264).
▪ 신호증폭 모듈을 도입한 모듈융합 유전자회로의 구축과 최적화
- cadC promoter와 operator, cadC 유전자를 T7 RNA polymerase와 융합하여 ‘센서증폭모듈’을 구축하였음.
- 기존의 CadC4657-egfp의 경우에는 10 μM 수준에서 카드뮴을 감지하였으나, 신호증폭모듈의 도입으로 10-100 nM 수준의 카드뮴 농도에서도 eGFP 형광신호가 증가하는 것으로 관찰되었으며, 증폭모듈의 도입으로 인하여 약 100-1000배 정도 카드뮴 감지능이 증가하는 것으로 나타남. 본 연구팀은 중금속탐지용 미생물센서를 개발하였고, 특허출원을 하였음 (대한민국특허출원, 10-2014-0148483).
제 4 세부 연구과제 : 식물 리포터 시스템 구축 및 구동 검증
▪ DR5-GUS/GFP시스템을 이용한 Toluene 리포터 식물제작
- In vitro 톨루엔 의존적 TodST-IAA 모듈의 작동 검증 및 정량화
- Pseudomonas putida (TodST-IAA) 근권 정착력 평가
- In vitro/In planta에서 톨루엔 의존적 TodST모듈의 IAA생산과 DR5-GUS 리포터 식물의 반응
- In planta에서 TMB 의존적 TodST모듈의 IAA생산과 DR5-GUS 리포터 식물의 반응
▪ ChlH RNAi 시스템을 이용한 Toluene 리포터 형질 전환 식물제작
- De-greeining 유전자 획득 및 발현 벡터 제작
- 제작한 RNAi 발현 벡터를 이용한 리포터 식물 구동 검증
- DR5-chlH RNAi 벡터가 도입된 담배에서 P. putida (TodST-IAA) 효과 검정
- 다양한 담배식물에 RNAi 발현 벡터 도입
제 5 세부 연구과제 : 바이오부품/회로 적용 감지식물 기술개발
▪ 방향족감지 유전자회로 개발
- 페놀,스티렌, 톨루엔, 자일렌, 불화에틸렌 등 방향족/휘발성 유해물질에 의하여 세포 내 리포터 발현이 정량적으로 증가하는 유전자회로 3종 개발(논문 준비중).
- 미생물-미생물, 미생물-식물 간 신호전달이 가능하도록 각 유전자 회로의 특성분석, 구동 검증 수행
▪ 호환성 바이오부품/회로 개발 :
- 방향족/휘발성 물질감지 센서단백질, 전사조절인자의 특이성 향상을 위한 단백질공학, 프로모터 개발 및 정량적 평가를 수행.
- 특히 식물세포가 Quorum물질인 AHL에 감응하도록 Vibrio LuxR에 Herpesvirus 유래 전사인자인 vp16를 다양하게 조합하여 미생물/식물에서 공통 사용할 수 있는 AHL 이용 유도발현 시스템을 개발(좌측그림). 이에 따라 식물에서도 AHL을 매개물질로 이용하여 고특이적 발현조절이 가능해짐. 현재는 식물에서의 발현 조절기전 및 특이성을 정량화하여 특허출원 및 논문준비 중임.
▪ 식물 내 유전자회로 구동 :
- 미생물 전사인자의 식물 내 발현/구동은 케이스에 따라 전혀 다르게 나타남. 예를 들어 2개-인자 신호전달시스템은 심각한 발현문제, 방향족 감지 전사조절단백질은 예측과 다른 구동특성 문제를 보였음.
▪ 시도된 여러 전사부품 중 정족수인식물질인 AHL감응 전사조절단백질(LuxR)만 식물 내에서 예측된 구동특성을 나타내었음. 따라서 식물 내에서는 LuxR을 구동시스템으로 사용하고 AHL을 매개자로 이용하여 주변 토양미생물(예: Pseudomonas putida)에서의 방향족 감지신호를 받아들이도록 하는 새로운 접근을 시도함.
- 이를 위하여 먼저 이종미생물 간 AHL이용 세포신호전달 체계를 먼저 구축하고 세포이미지 분석 및 FACS분석을 통하여 구동 검증.
▪ 미생물 3D프린팅 이용기술 :
- AHL감지 유전자회로를 도입한 미생물을 배지평면에 고집적프린팅(중간그림)하고 토양/환경시료+미생물 조합을 인가하여 페놀 등 방향족 물질이 존재하는 경우 AHL을 경유하여 미생물프린트에서 형광이 관찰되는 시스템을 구축함. 이를 바탕으로 다양한 2개-인자센서를 이용 유해화합물 감지를 관찰하는 단계의 연구를 수행중임.
▪ 유해물질 가시화기술 :
- 미생물 고집적프린트, 양파세포, 담배 잎에서 형광이미지 분석을 통하여 유해 방향족 물질을 가시화하는 기술을 구축함. 이 결과는 향후 유해물질 감지 식물종자 개발을 위한 기초자료로 활용예정임.

Abstract ▼

Synthetic biology is a new area of biological engineering that synthesizes new biological molecules, pathways, and networks to rewire and reprogram organisms. The engineering rules are expected to lead our lives closer to new chemicals, green fuels, and targeted therapies for diseases.
A particul

Synthetic biology is a new area of biological engineering that synthesizes new biological molecules, pathways, and networks to rewire and reprogram organisms. The engineering rules are expected to lead our lives closer to new chemicals, green fuels, and targeted therapies for diseases.
A particular interest has been given to the development of sentinel plants or phyto-sensors to provide a rapid, low-cost, in-situ monitoring of environmental hazards and plant diseases. The sensors are useful for the ecological risk assessment of agricultural and industrial chemicals. In this regard, we are interested in developing phyto-sensors that sense hazardous aromatics such as volatile organic compounds and explosive trinitrotoluene.
In this study, we address to use cell to cell communication system among bacterial-bacterial cells or bacterial-plant cells as well modular sensors which consists of sender and receiver cells. The sender cells secrete N-acyl homoserine lactones (AHL) known as a quorum sensing molecule by sensing extra-cellular phenol compound. Once the AHL molecules are detected by the receiver cells, they express reporter proteins such as Green Fluorescence Proteins. One of advantages of this modular sensing system is that it can be applicable to heterogeneous microorganisms having different regulator genes to detect a wide range of environmentally harmful substances. Moreover, this well modularized sensor system shows higher sensitivity and reporter intensity than a whole-cell sensing system. We also confirmed the possibility of the development of microorganism-plant sensors detecting environmentally harmful substances by building a cellular receptor that responds to AHL in plants.