보고서 정보
주관연구기관 |
서도비엔아이(주) |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-01 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011170 |
과제고유번호 |
1545007370 |
사업명 |
고부가가치식품기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011170 |
초록
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IV. 연구개발결과
1. Anthocyanin계 천연색소의 원료선별
Anthocyanin계 천연색소의 원료선별을 위하여 복분자, 오디, 자영 및 홍영의 Anthocyanin 함량, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량, 생리활성 등을 분석하였다. 베리류에서는 복분자가 오디에 비하여 총 Anthocyanin 함량, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량이 더 높게 나타났으며 생리활성 측면에서도 SOD-like activity, hydroxyl radical
IV. 연구개발결과
1. Anthocyanin계 천연색소의 원료선별
Anthocyanin계 천연색소의 원료선별을 위하여 복분자, 오디, 자영 및 홍영의 Anthocyanin 함량, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량, 생리활성 등을 분석하였다. 베리류에서는 복분자가 오디에 비하여 총 Anthocyanin 함량, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량이 더 높게 나타났으며 생리활성 측면에서도 SOD-like activity, hydroxyl radical 소거능, hydrogen peroxide 소거능, elastase 저해 활성능이 더 높게 나타났다. 컬러감자에서는 홍영이자영에 비하여 총 Anthocyanin 함량, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량이 더 높게 나타났으며 DPPH radical 소거능, SOD-like activity, hydroxyl radical 소거능, hydrogen peroxide 소거능 등의 항산화 실험에서도 더 높은 활성을 보였다.
2. Anthocyanin계 천연색소의 ethanol 추출조건 설정
Anthocyanin계 천연색소의 ethanol 추출공정 개발을 위하여 중심합성계획법 (central composite design)을 사용하였다. 15개의 실험 점 가운데 복분자의 ethanol 추출 시Anthocyanin 함량이 가장 큰 조건은 시료 대 용매비율 15% (w/v), 추출온도 30℃, 추출시간 1시간으로 나타났고, 반응표면분석법(RSM, response surface methodology)으로 분석한 결과 복분자의 최적 추출조건으로서 시료 대 용매비율 11.71% (w/v), 추출온도 30℃, 추출시간 1시간이었으며 그 때의 Anthocyanin 함량은 0.52 mg/100 g으로 나타났다. 홍영의 경우는 15개의 실험 점 가운데 시료 대 용매비율 20% (w/v), 추출온도 50℃, 추출시간 5시간 일 때 Anthocyanin 함량이 가장 높게 나타났고, RSM으로 분석한 결과 홍영의 최적 추출조건은 시료대 용매비율 20% (w/v), 추출온도 58.26℃, 추출시간 5시간이었으며, 최적조건에서 추출물의 Anthocyanin 함량은 0.22 mg/100 g으로 분석되었다.
3. Anthocyanin계 천연색소의 최적화 추출조건 설정
추출에 가장 적합한 산도조절제 선정을 위한 후보군으로 구연산 (CA, citric acid)와 산성메타인산나트륨 (ASM, Acidic Sodium Metaphosphate)을 설정하였다. 다른 추출조건은 참고문헌 및 예비실험을 통해 추출온도(40℃), 추출시간(3시간), 산도조절제 농도(1.0%), ethanol 함량 (30%, w/v), 시료 대 용매 비율(1:10, w/v)을 설정해서 추출물을 제조하였으며, 각 추출액의 Anthocyanin을 분석한 결과 ASM이 CA보다 추출효율이 높은 것으로 확인되어 ASM이 바람직하다는 결과를 얻었다. 각 시료에서 추출온도와 시료 대 용매 비율을 고정하고 추출시간을 3시간 이상으로 하였을 때, Anthocyanin 함량이 감소하는 경향을 보였기 때문에 3시간 추출이 가장 효과적임을 알 수 있었다. 시료 대 용매 비율, ASM 함량, 추출온도, 추출시간을 고정하고 ethanol 함량 (20 ~80%)에 따른 Anthocyanin 함량은 30% ethanol에서 대조군 대비 18% 증가하였고, 시료 대 용매 비율, ethanol 함량, 추출온도, 추출시간을 고정하고 ASM 함량 (0.5 ~ 1.0%)에 따른 Anthocyanin의 함량은 0.7% ASM에서 대조군 대비 24% 증가하는 경향을 보였다. 대량생산을 위한 경제성 및 효율성과 최적화된 추출 조건 확립을 위해 다양한 요인들에 대한 추출 조건을 확인하였으며 식품첨가물로서의 사용을 위한 추출 조건 중 추출용매는 30% (w/v) ethanol과 0.7%의 산도조절제가 혼합된 용매를 원료 대비 10배, 추출온도 50℃, 추출시간 3시간 및 추출 횟수 2회로 설정하였다.
4. Anthocyanin계 천연색소의 최적 효소처리 공정 개발
Anthocyanin계 추출물의 수율, phytochemical 함량 및 항산화활성 향상을 위해 Pectinex Ultra SP-L과 Novozym 33095로 최적 효소처리 공정을 개발하였다. Pectinex Ultra SP-L에 대한 요인은 세 가지로서 시료에 대한 효소농도 (0.5-1.5 mL/100 L), 반응온도 (20-60℃), 반응 시간 (2-8 시간)이었고, Novozym 33095에 대한 요인도 세 가지로서 시료에 대한 효소농도 (0.05-0.25 mL/L), 반응온도 (20-60℃), 반응시간 (60-120 분)이었으며, 그에 따른 수율, 총폴리페놀 함량, Total Flavonoid 함량, 총 Anthocyanin 함량, DPPH radical 소거능 및 SOD-like 활성능을 반응표면분석법에 의하여 최적화하였다. 효소 처리를 한 결과, 복분자, 오디, 자영 및 홍영 모두에 대해 Novozyme 33095 처리 보다 Pectinex Ultra SP-L 처리를 하였을 때 수율, Total Polyphenol 함량, Total Flavonoid 함량, 총 Anthocyanin 함량, DPPH radical 소거능 및 SOD-like 활성능이 더 높게 나타났다.
5. Anthocyanin계 천연색소의 안정화 기술 개발
HPLC를 통해 분석한 Anthocyanin 표준물질 (Cyanidin-3-glucoside)의 RT와 복분자박 농축액의 RT가 매우 유사하게 측정되었으며, 복분자 박 추출물 역시 표준물질과 매우 유사하게 측정되었다. 따라서 복분자박 유래 Anthocyanin계 천연색소 역시 Cyanidin-3-glucoside가 주요 Anthocyanin 물질임을 확인할 수 있었다. 색소의 안정성 평가에서 Anthocyanin계 천연색소는 낮은 pH에서의 적색 발현성이 좋은 것으로 확인되었고 pH가 낮을수록 고온에서 장시간 가열처리를 하여도 색소의 감소율은 크지 않음을 확인하였으며, 빛에 대한 안정성 역시 낮은 pH에서 효과적으로 나타났다. 또한 다양한 당류 (fructose, maltose, sucrose, glucose, galactose)의 첨가 비율에 따라 안정성이 다르게 나타났으며 그 중 sucrose에 의한 안정화 효과가 다른 당류에 비해 효과적이었다. Anthocyanin의 구조적 안정화를 위한 copigment로 널리 알려진 방향족 페놀산류인 tannic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, hydrobenzoic acid를 선택하여 처리한 결과, 모든 방향족 페놀산류에서 안정화 효과를 나타내었다.
6. 복분자박 천연색소로부터 Anthocyanin의 최적 분리정제 기술 개발
복분자박으로부터 최적의 ethanol 추출 조건과 효소 처리 조건에 의해 제조한 추출물을 이용하여 Anthocyanin의 분리정제 기술을 개발하기 위해 sorbent로 MCX SPE cartridge, HP-20 및 Amberlite XAD-7을 사용하였고, pH 조절제로 HCl 또는 TFA의 농도 (0.1-1.0%)와 용출제로 ethanol의 농도 (60-90%)에 따른 수율, 색가 및 총 Anthocyanin 함량을 반응표면분석법에 의하여 최적화하였다. 예측된 최적 조건을 종합적으로 볼 때, 모든 흡착제에서 pH 조절제로서 TFA 보다 HCl 사용 시 수율, 색가 및 총 Anthocyanin 함량이 높게 나타났기 때문에 HCl을 사용하였을 때의 최적 정제 조건에 의해 분리정제를 하는 것이 바람직하다고 사료된다.
7. Citric acid의 농도에 따라 분리정제 한 Anthocyanin의 기능성 비교
식품첨가물공전에 의하면 Anthocyanin계 천연색소 제조 시 HCl이나 TFA과 같은 강산을 사용할 수 없기 때문에 Anthocyanin계 천연색소를 식품첨가물로서 이용하기 위해 식용 가능한 유기산인 citric acid를 pH 조절제로 사용하여 Anthocyanin을 분리정제 하였다. 최적의 ethanol 추출 공정 및 효소 처리 공정에 따라 제조된 추출물을 HP-20 sorbent로 분리정제 하였고, 흡착된 Anthocyanin을 용출하기 위해 용출제로 60% ethanol과 pH 조절제로 citric acid (0-1.0%, w/v)를 사용하여 비교 분석하였다. Citric acid 0.7% 조건에서 항산화활성이 높게 나타났으며, Total Anthocyanin 함량은 9.6 mg/100 g으로 HCl이나 TFA를 사용하였을 때에 비해 59.0-86.2% 정도로 다소 낮게 나타났지만 식품첨가물로서 Anthocyanin계 천연색소를 사용하기 위해서는 citric acid의 사용이 바람직할 것이다.
8. 추출용매 재사용에 따라 제조된 시제품들에 대한 분석
복분자박 유래 천연색소의 생산원가 절감 및 경제성을 고려하여 추출용매를 재사용하였으며 그에 따른 시제품들의 생리활성 측정 결과와 색가, Total Anthocyanin 함량 측정 결과를 종합해보면 전반적으로 추출용매를 재사용하여도 시제품들의 품질 (색가, Total Anthocyanin 함량, 생리활성)에는 큰 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 또한, 추출용매를 재사용하여 제조한 시제품들의 휘발성 성분을 분석하기 위해 SPME로 추출하고 GC-MS를 이용하여 분석하였을 때, 시료에 따라 46-68개의 휘발성 성분이 동정되었으나 동정된 향기성분에서는 이취 성분이 나타나지 않았다.
9. 효소 처리에 따라 제조된 시제품들에 대한 분석
용매추출 단계에서 사용되는 효소의 종류에 따라 제조된 시제품들의 생리활성 측정 결과와 색가, Total Anthocyanin 함량 측정 결과를 종합해보면 전반적으로 Pectinex Ultra SP-L을 사용하여 제조된 시제품이 좋은 결과를 나타냈다. 따라서 복분자 박 유래 천연색소 추출 시 용매추출 단계에서 다른 효소보다는 Pectinex Ultra SP-L을 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다. 또한, 효소 처리를 달리하여 제조한 시제품들의 휘발성 성분을 분석하기 위해 SPME로 추출하고 GC-MS를 이용하여 분석하였을 때, 시료에 따라 39-50개의 휘발성 성분이 동정되었으나 동정된 향기성분에서는 이취 성분이 나타나지 않았다.
10. Anthocyanin계 천연색소의 다양한 적용실험
Anthocyanin계 천연색소를 생강초절임(Ginger pickling)에 적용하였을 때, 코치닐 추출색소와 유사한 염착력을 나타내었다. 제빵에 대한 응용실험에서 머핀을 제조하였을 때, 조리 후에도 적색이 발현되고 유지되는 것을 확인하였다. 오징어 진미채에 대한 실험에서는 시중에 유통중인 천연색소 혼합제제(치자황색소, 홍국색소, 고량색소 등 혼합제제)와 비교하였을 때 유사한 염착력을 나타내는 것을 확인하였다.
Abstract
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1. Screening of raw material for natural pigment Anthocyanins extraction
Total Anthocyanin contents, Total Polyphenol contents, Total Flavonoid contents and bioactivies of Bokbunja, mulberry, purple-fleshed potato and red-fleshed potato were analyzed for screening of raw material. Bokbunja had hi
1. Screening of raw material for natural pigment Anthocyanins extraction
Total Anthocyanin contents, Total Polyphenol contents, Total Flavonoid contents and bioactivies of Bokbunja, mulberry, purple-fleshed potato and red-fleshed potato were analyzed for screening of raw material. Bokbunja had higher values of Total Anthocyanin contents, Total Polyphenol contents, Total Flavonoid contents, SOD-like activity, hydroxyl radical scavenging activity, hydrogen peroxide scavenging activity and elastase inhibitory activity than mulberry in berries. Red-fleshed potato had higher values of Total Anthocyanin contents, Total Polyphenol contents, Total Flavonoid contents, DPPH radical scavenging activity, SOD-like activity, hydroxyl radical scavenging activity and hydrogen peroxide scavenging activity than purple-fleshed potato in color potatoes.
2. Development of optimal ethanol extraction conditions of natural pigment Anthocyanins
RSM(Response Surface Methodology) was carried out for the process optimization of Anthocyanin ethanol extraction from Bokbunja and red-fleshed potato. The ranges of independent variables selected from the preliminary experiments results. Interesting ranges of independent variables were sample to ethanol ratio 10-20%, extraction temperature 30-70℃, and extraction time 1-5 hr, respectively. As a result, proposed optimal extraction conditions from Bokbunja were 11.71% of sample to ethanol ratio, 30℃ of extraction temperature, and 1 hr of extraction time, respectively. In above optimal extraction conditions, Total Anthocyanin contents from Bokbunja was 0.52 mg/100 g. The proposed optimal extraction conditions from red-fleshed potato were 20% of sample to ethanol ratio, 50℃ of extraction temperature, and 5 hr of extraction time, respectively. In above optimal extraction conditions, Total Anthocyanin contents from red-fleshed potato was 0.22 mg/100g.
3. Optimal extraction conditions for set up experiment
Mulberry extract conditions were extraction temperature 40℃, extraction time 3 hr, concentration of CA or ASM 1.0%, ethanol 30% and the sample to solvent ratio 1:10 (w/v), respectively, in order to make comparison of extraction efficiency between citric acid(CA) and acidic sodium metaphosphate(ASM) as pH adjusters. Absorption rate value of Anthocyanins in ASM had higher than that in CA, and pH increased slightly increased during extraction. Optimal extraction time was 3 hr for maximizing Anthocyanin absorbance with fixing the extraction temperature, sample to solvent ratio in the sample conditions. Anthocyanin absorbance rate of mulberry was 117.80% at 30% ethanol concentration with fixing the sample to solvent ratio, concentration of ASM, extraction temperature and extraction time. Mulberry Anthocyanin absorbance rate was the highest value 123.73% in 0.7% of ASM with fixing the sample to solvent ratio, concentration of ethanol, extraction temperature and extraction time.
4. Optimal enzyme treatment condition
The pectinase enzyme, Pectinex Ultra SP-L(PEC) or Novozym 33095(NOV) was treated to Bokbunja, mulberry, purple-fleshed potato and red-fleshed potato extracts in order to raise yield, phytochemical concentrations and bioactive properties. RSM was employed to obtain the optimal enzyme treatment conditions from Bokbunja, mulberry, purple-fleshed potato and red-fleshed potato extracts. Ranges of independent variables selected from the preliminary experiments were enzyme concentration 0.5-1.5 mL/100 L(PEC) or 0.05-0.25 mL/L(NOV) and enzyme reaction temperature and time 20-60℃(both PEC and NOV) and 2-8 hr(PEC) or 60-120 min(NOV), respectively. Pectinex Ultra SP-L treatment had higher values of yield, Total Polyphenol contents, Total Flavonoid contents, Total Anthocyanin contents, DPPH radical scavenging activity and SOD-like activity than Novozym 33095 treatment in all samples.
5. Stabilization technologies of natural pigment Anthocyanins
RT of Bokbunja byproduct Anthocyanin was very similar to that of standard material(Cyanidin-3-glucoside, C3G) based on HPLC analysis. Therefore, it was confirmed that C3G is the major component of Bokbunja byproduct Anthocyanin. For the stability of Anthocyanin during long term heat treatment, it was found to stabilize at the low pH (pH 3 or less) condition. Also, added sugars(fructose, maltose, sucrose, glucose, galactose) in Bokbunja byproduct Anthocyanin showed different stability depending on the added ratio.
6. Optimal isolation condition from Bokbunja byproducts
For the optimal isolation process of Anthocyanin from Bokbunja byproduct extracts, MCX SPE cartridge, HP-20 and Amberlite XAD-7 as sorbents were used with pH adjuster of ethanol(60-90%), HCl or TFA(0.1-1.0%). The yield, color value and Total Anthocyanin contents evaluated as response variables. Regardless of sorbents, HCl worked better than TFA as a pH adjuster for all response variables, which was worthwhile to be used for the recovery of Anthocyanin under optimal isolation conditions.
7. Comparison of the isolated Anthocyanin functionality according to the concentration of citric acid
The Anthocyanin, as a food additive, isolated from Bokbunja byproducts extracts using citric acid as a pH adjuster. In the range of citric acid from 0 to 1.0%(w/v) into a 60% ethanol, optimum concentration of citric acid was 0.7%(w/v) which had the highest Total Anthocyanin contents as well as bio-activities. Total Anthocyanin content(9.59 mg/100 g) with 0.7% citric acid was about 58.98-86.16% compared to that with HCl or TFA. However, citric acid is preferred to use for Anthocyanin pigment isolation owing to safety.
8. Analysis of the prototype according to the reuse of the extractant
Antho-Red KR(140416) extracted with a third recovery solvent was the highest values than the Antho-Red KR(140305) extracted with new solvent, and Antho-Red KR(140418) extracted with quaternary recovery solvent was lowest value based on bioactivities, color value and Total Anthocyanin contents. Thus, the reuse of the extractant up to third recovery was effective to extract Anthocyanin. To analyze the volatile components of extraction in SPME using GC-MS, 46-68 kinds of volatile components were identified based on the sample. The off-flavor components were not identified in volatile components.
9. Analysis of the prototype produced in accordance with the type of enzyme used during the extraction
Based on bioactivities, color value and Total Anthocyanin contents of the manufactured prototype, Antho-Red(140430) with Pectinex SP-L were higher values than that with Novozym 33095. To analyze the volatile components of the prototype extracted with enzyme, the extraction of volatile components in SPME and analyzed using GC-MS. 39-50 kinds of volatile components were identified according to the sample, The off-flavor components were not identified in volatile components.
10. Various application tests of natural pigment Anthocyanins
The Anthocyanin from Bokbunja byproduct applied to the pickled ginger, it was showed that color and salt adhesion similar to the extracted pigment from cochineal. Preparing a muffin for baking application test, it was confirmed that the red color expressed and maintained after cooking. In experiments on squid jinmichae, Anthocyanin from Bokbunja byproduct showed the similar color and salt adhesion to the other natural pigment mixture formulation(mixture formulation like gardenia yellow pigment, red yeast rice pigment, kaoliang pigment etc.).
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