보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2015-01 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011181 |
과제고유번호 |
1545007312 |
사업명 |
수출전략기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011181 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. Laccase 유전자 확보
가. 확보된 바실러스 균주의 게놈으로부터 Laccase 유전자 확보
- 다양한 Laccase 효소자원을 수집하기 위하여 총 126주의 바실러스 균주를 수집하였고 이들에 대해 항진균 활성 및 항세균 활성을 측정하였음.
- 그 결과 29종의 바실러스 균주가 곰팡이 Rhizoctonia solani에 대한 항진균 활성을 보였고 32종이 Botrytis cinerea에 활성을 보임. 그람양성균인 Micrococcus luteus에 대한 항세균 활성을 보인 균주는 20종
Ⅳ. 연구개발결과
1. Laccase 유전자 확보
가. 확보된 바실러스 균주의 게놈으로부터 Laccase 유전자 확보
- 다양한 Laccase 효소자원을 수집하기 위하여 총 126주의 바실러스 균주를 수집하였고 이들에 대해 항진균 활성 및 항세균 활성을 측정하였음.
- 그 결과 29종의 바실러스 균주가 곰팡이 Rhizoctonia solani에 대한 항진균 활성을 보였고 32종이 Botrytis cinerea에 활성을 보임. 그람양성균인 Micrococcus luteus에 대한 항세균 활성을 보인 균주는 20종이었음.
- 알려진 여러 바실러스 종의 laccase 유전자 염기서열을 확보하여 비교한 결과 homology가 많이 다름을 알 수 있었는데, 이는 바실러스 laccase가 종마다 서로 다른 염기서열을 가진다는 것을 알 수 있음.
- 바실러스 균주로부터 총 26종의 laccase 유전자를 확보하였고, 기 확보된 바실러스 발현시스템을 이용하여 바실러스 서틸리스 168 균주에서 6종의 laccase 유전자를 과발현하였음.
나. Laccase의 특성 분석
- 과발현된 6종의 laccase 유전자 중, 바실러스 서틸리스 laccase에 대한 특성을 분석하였음.
- Laccase는 세포 내에서 발현되는 단백질이므로 발현된 단백질의 효율적인 회수를 위하여 단백질이 세포 밖으로 분비될 수 있도록 단백질 분해효소 (aprE)의 signal peptide를 붙여 발현하였음. 그 결과 세포 내에서만 laccase가 과발현됨을 확인하였음.
- Laccase가 세포 내에서 발현되는 단백질이나 대부분 효소 활성이 상등액에 존재하는 것으로 보아 laccase가 세포 내에서 발현되었지만 자가분해 (autolysis)에 의해 세포 밖으로 분비된 것으로 생각됨.
- 바실러스 서틸리스에는 8개의 세포외 단백질 분해효소 (extracellular proteases)가 존재하여 발현된 단백질이 쉽게 분해될 수 있음.
- 8개의 세포외 단백질 분해효소가 결핍된 WB800N 균주에서의 효소 활성과 바실러스 서틸리스 168의 효소 활성이 비슷한 것으로 보아, laccase가 세포외 단백질 분해효소에 의해 쉽게 분해되지 않음을 확인하였음. 과발현된 laccase를 상온에서 30일 이상 보관하여도 효소 활성이 유지되는 것을 확인하였음.
- Laccase를 다양한 유기용매들과 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 효소 활성을 검정해본 결과, 에탄올, 2-propanol, 아세톤, triton X-100에 대하여 그 활성이 유지됨을 확인함.
- 상업적 발현벡터 (pHT01)를 이용하여 제작한 laccase 발현 균주와 본 연구에서 사용한 laccase 과발현 균주의 효소 발현 정도를 비교해보고자 함.
- 본 연구의 발현 시스템을 이용한 균주와 상업적으로 판매되는 발현 벡터를 이용한 균주의 효소 활성을 측정해 본 결과, 본 연구팀의 발현시스템을 이용한 균주의 효소 활성이 상업적으로 판매되는 벡터를 이용한 효소 활성보다 약 10배 이상 높게 나타남.
- 포자형성 배지에서 균주 배양 후 포자 표면에서의 효소 활성을 비교한 결과, 상업적 발현 시스템에 의한 효소 활성보다 본 연구의 발현시스템에 의한 효소 활성이 10배 이상 높게 나타났음. 과발현된 laccase는 120시간까지 포자 표면에서 잘 발현되며 활성이 안정하게 유지됨.
- laccase가 화학물질을 분해하는지 알아보기 위해 염색시약인 indigo carmine과 laccase 과발현 균주를 반응시킨 후 과발현한 laccase가 indigo carmine을 모두 분해시킴을 확인하였음.
다. 유기인계화합물 가수분해효소 (OPH)의 과발현
- 생물학적 환경정화 (bioremediation)는 미생물, 곰팡이, 식물 또는 그 효소를 이용하여 오염 물질을 제거하는 방법임.
- 최근 유기인계화합물의 분해에 효소를 이용한 생물학적 처리 방법들이 관심을 받고 있음. 그 중, 유기인계화합물 가수분해효소 (OPH)는 농약뿐만 아니라 사린 가스 등과 같은 생화학무기용 화학물질의 해독 작용에 관여함.
- Flavobacterium의 OPH 유전자를 확보하여 바실러스 서틸리스 168에서 기 개발된 바실러스 발현시스템을 이용하여 과발현하였음.
- 메틸 파라치온을 기질로 사용하여 OPH가 바실러스에서 과발현 되었음을 확인하였음.
2. 분자진화기술을 이용한 Laccase 효소 개량
- 분자진화 (Directed evolution) 기술은 목적 단백질 또는 생명체를 우리가 원하는 특성을 갖도록 초고속으로 개량하는 기술임.
- 분자진화 기술을 이용한 laccase 개량을 위해 먼저 스크리닝 시스템을 구축할 필요가 있었음.
- Bromophenol blue, Indigo carmine, Tannic acid, ABTS 등 다양한 laccase 기질을 사용하여 고체 배지에서 활성을 검정한 결과 0.25 mM CuCl2와 0.4mM의 ABTS가 들어 있는 1/3 TSA 배지가 스크리닝에 가장 적합하였음.
- 바실러스 서틸리스 laccase 유전자를 Clontech 사의 Diversify PCR mutagenesis kit를 이용하여 error prone PCR을 수행하고 본 연구의 발현시스템에 클로닝하여 바실러스 서틸리스에 도입하였음. 위에서 언급된 스크리닝 배지에 도말하여 우수한 활성을 보이는 다양한 콜로니를 확보할 수 있었음.
- 활성이 우수해 보이는 후보군 10개를 선별하여 laccase assay를 통해 개량 전의 효소 활성보다 약 0.5~3배 이상 높아졌음을 확인함.
- 각 후보군의 laccase 활성이 다양하게 나타나 laccase 유전자의 아미노산 서열을 분석한 결과, 후보군마다 서로 다른 부분에 변이가 생성됨을 확인함.
3. non-GMO 바실러스 게놈 엔지니어링 기술 개발
- 특정 효소가 고발현된 균주를 제작하는 방법은 random mutagenesis 또는 유전공학적 기법을 이용한 rational mutagenesis가 있음.
- Random mutagenesis 방법은 wild-type 균주에 UV 또는 화학 물질을 처리하여 게놈 상에서 무작위로 돌연변이를 일으키는 방법으로 원하는 형질을 가진 돌연변이체가 찾아질 때까지 반복함. 그러나 원하는 돌연변이가 생길 확률이 매우 낮고 원하지 않는 돌연변이가 게놈상에서 축적되어 세포 성장이나 포자형성에 문제가 발생할 가능성이 높음. 또한 원하는 형질을 가진 돌연변이체를 얻기까지 시간이 많이 걸리며 새로운 타겟이 생기면 처음부터 사이클을 다시 반복해야 한다는 단점이 있음.
- 유전공학적 기법을 이용한 Rational mutagenesis의 경우 원하는 유전자만 선택적으로 돌연변이를 시킬 수 있지만 스크리닝을 위해 항생제 저항성 유전자를 사용하기 때문에 GMO 균주로써 환경에 직접 사용할 수 없다는 단점이 있음.
- 따라서 본 연구에서는 외래 유전자의 흔적을 전혀 남기지 않고 특정 유전자의 돌연변이를 유도하는 새로운 원천기술을 개발하였음.
- 먼저 바실러스에서 고효율 형질전환 기술을 개발할 필요가 있었음.
- 바실러스의 natural comtetency를 이용한 형질전환 기작에서 key regulator 역할을 하는 것이 ComK임. ComK가 활성화된 균주는 형질전환 효율이 증가하도록 조작하여 형질전환 효율이 획기적으로 증가된 바실러스 균주를 제작하였음.
가. counter-selectable marker를 위한 합성유전자 회로 설계
- 흔적을 남기지 않는 게놈 엔지니어링 기술은 효율적인 counter-selectable marker (CSM)가 필요함.
- 기존에 사용되었던 CSM인 upp, blaI, araR 등은 게놈 상에 다른 특정 mutation이 필요하기 때문에 이로 인한 돌연변이체는 GMO임. mazF의 경우 세포에 대한 독성을 가지고 있어 매우 많은 false-positive가 발생하여 원하는 돌연변이를 찾기가 매우 어려움.
- 이들의 단점을 극복하고자 합성생물학에서 많이 사용되는 핵심 기술인 합성 유전자 회로를 사용하여 CSM을 위한 새로운 방법을 개발하였음. 새로 설계된 유전자 회로는 두 개의 프로모터와 두 개의 repressor 유전자로 구성되어 있음.
- Repressor 1은 항상 발현하고 있으며 프로모터 1에 작용하여 Repressor 2 발현을 억제함. 이는 Repressor 2의 조절을 받는 프로모터 2로부터 reporter의 발현을 유도하여 detection이 가능하게 함. 여기에 inducer 1을 넣어주면 Repressor 1의 작용을 방해하여 repressor 2의 발현을 유도함. 발현된 Repressor 2는 프로모터 2의 발현을 방해하여 reporter를 detection 할 수 없음. reporter를 detection 하기 위해서는 프로모터 1과 repressor 2가 제거되어야만 함. 따라서 이것이 CSM으로 작용할 수 있게 됨.
- 본 연구에서는 프로모터 1에는 xylose로 발현이 유도되는 바실러스 서틸리스 xylA 프로모터 (Pxyl)를, 프로모터 2에는 IPTG로 발현이 유도되는 spac 프로모터 (Pspac)을, repressor 1에는 xylR 유전자를, repressor 2에는 lacI 유전자를 reporter에는 클로르암페니콜 저항성 유전자 (cat)을 사용하였음.
나. 합성유전자 회로를 이용한 non-GMO 균주 제작
- 이렇게 제작된 유전자 합성 회로를 CSM로 사용 가능한 지 여부를 검정하였음. 바실러스 서틸리스 168 균주는 tryptophan auxotroph (Trp-)로, 이는 trpC 유전자 내에 3개의 염기 (ATT)가 결실된 것이 원인임. 본 연구에서 3개의 염기를 다시 삽입하여 tryptophan 의존성을 없앤 균주 (Trp+)를 신규 합성 유전자 회로를 사용하여 제작하였음.
- 제작된 균주 Trp+는 tryptophan이 포함되지 않은 최소배지에서도 잘 자라는 것으로 보아 trpC 유전자의 기능이 회복되었음을 알 수 있음.
- 다음으로 게놈 상에서 특정 염기의 제거 또는 point mutation도 용이하게 이루어진다는 사실을 증명하였음.
- 먼저 deletion mutant 제작을 위해 단백질 분해효소인 aprE 유전자에서 두 개의 염기 (GT)가 제거되도록 하였고, point mutant 제작을 위해서는 단백질 분해효소 nprE 유전자의 A가 T로 바뀌어 stop codon이 생기도록 하였음.
- 상기 Trp+ 균주 제작과 같은 방법으로 Trp+ AprE-, Trp+ NprE-, Trp+ AprE- NprE- 균주를 제작하였음. 제작된 균주들의 단백질 분해효소 활성을 측정한 결과 wild type에 비해 mutant 모두 활성이 감소한 것으로 보아 mutant가 잘 만들어 졌음을 알 수 있음.
- 합성유전자 회로의 광범위한 사용을 위하여 전체 유전자 또는 오페론의 deletion mutant를 만들기로 함.
- 먼저 유전자의 deletion mutant를 만들기 위해 탄수화물 분해효소인 amyE 유전자에서 대부분의 염기 (약 2 kb)가 제거되도록 하였음. 고체 배지 상에서 요오드/녹말 반응을 통해 amyE- mutant에서 효소의 활성이 사라짐을 확인하였고, PCR을 이용하여 amyE 유전자가 제거되었음을 확인하였음.
- 또한 항진균활성을 나타내는 fengycin 생합성 관련 유전자 집단인 pps 오페론 (ppsABCDE)에서 이를 구성하고 있는 유전자 집단이 제거될 수 있도록 제작하였음. PCR을 통해 pps 오페론이 확실히 제거되었음을 확인하였음.
- 따라서 본 연구에서 개발된 게놈 엔지니어링 기술은 게놈 상에서 insertion, deletion 및 point mutation 등 모든 mutation을 매우 효율적으로 제작할 수 있음을 확인하였음.
다. Laccase 과발현 균주 제작 및 농약분해능 시험
- Laccase가 과발현된 균주를 친환경적으로 만들면 농약분해 용도로 균주 또는 포자형태의 제품을 만들 수 있을 것이라 생각됨.
- 바실러스 균주는 항균활성이 우수하므로 농약분해효과 뿐만 아니라 병원성 곰팡이의 발병을 억제하는 두 가지 효과를 기대할 수 있을 것임.
- 본 연구에서 개발된 non-GMO 균주 제작 기술을 이용하여 바실러스 laccase가 과발현된 친환경 균주를 제작하였음. 이를 위해 laccase를 암호화하고 있는 cotA 유전자 개시 코돈 바로 앞 부위에 바실러스에서 유래된 프로모터를 다른 외래 유전자의 흔적을 남기지 않고 삽입하였음.
- 이렇게 제작된 Laccase 과발현 균주 (nonGMO cotA)는 laccase assay를 통해 과발현되었음을 확인하였음.
- 구리를 첨가한 최소 배지 CHPYG1에 ABTS를 기질로 사용하여 non-GMO Laccase 과발현 균주를 처리함. 과발현된 laccase에 ABTS가 산화되어 배지의 색이 보라색으로 바뀌는 것을 확인하였음.
- 다양한 살충제의 전구체로 사용되며 살충제인 카바릴과 나프탈렌의 대사산물인 1-naphthol은 분해되면 검은색을 나타냄.
- 1-naphthol이 첨가된 최소 배지 CHPYG1에서 각 균주를 키워 콜로니의 색깔 변화를 살펴본 결과, non-GMO Laccase 과발현 균주와 laccase, OPH를 함께 과발현한 균주가 검은색 콜로니를 나타냄.
- 최소 배지 CHPYG1에 유기인계 살충제인 chlorpyrifos를 첨가하여 non-GMO Laccase 과발현 균주와 OPH 과발현 균주에 의한 clear zone을 관찰하였음. Laccase, OPH를 함께 발현한 균주가 OPH 과발현 균주보다 약 1.5배정도 높은 activity를 나타내 laccase와 OPH가 농약 분해에 있어 시너지 효과를 나타내는 것으로 여겨짐.
4. 단백질 대량 생산을 위한 바실러스 발현시스템 개발
가. 프로모터 변이체를 이용한 단백질 생산 방법
- 바실러스는 산업적으로 유용한 단백질을 생산하는 주요 숙주로 사용되지만 대장균과 비교하여 바실러스에는 강력하고 조절 가능한 프로모터가 없고, 많은 단백질 분해효소의 존재로 인하여 발현된 단백질의 안정성에 문제가 있음.
- 이를 해결하기 위하여 Bacillus thuringiensis cry 프로모터의 상위 부위에 B. subtilis 유래의 aprE 프로모터 또는 rapA 프로모터를 포함하는 프로모터 변이체를 개발하였음.
- 단백질 분해효소인 AprE를 리포터 단백질로 사용하여 각 프로모터 변이체의 하위에 위치시키고, AprE의 발현량을 확인하였음.
- 각 프로모터 변이체들은 모두 개량된 프로모터 P84에 비해 유전자 발현량이 2배 이상 증진함을 확인하였음.
- 또다른 프로모터 변이체로 Bt Cry 프로모터의 상위 영역에 뉴클레오타이드 아데닌 (A)과 티민 (T)이 풍부한 UP 엘리먼트를 첨가하는 프로모터 변이체를 제작하였음.
- GFP를 리포터 단백질로 사용하여 발현량이 증가된 프로모터를 스크리닝하였음. 활성이 우수한 7개 프로모터 변이체를 선별하였고, 선별된 프로모터들은 기존 개량된 cry 프로모터인 P84보다 GFP 활성이 20~30배 이상 증가된 것을 확인하였음.
- 프로모터 변이체 중 대표적으로 PuryC13과 PuryC23을 이용하여 목적 단백질인 단백질 분해효소 AprE를 발현하였고, P84 프로모터보다 활성이 2배 이상 증가되었음을 확인함.
나. 번역수준 조절을 통한 발현 라이브러리 제작
- 단백질의 번역 과정에서 같은 아미노산을 지정하는 코돈이 2종류 이상임에도 특정 종류의 코돈이 다른 코돈보다 많이 사용되는 현상을 코돈 치우침 (Codon bias)이라 함.
- 그러나 최근 연구 (Kudla et al. 2009)에서 코돈 치우침은 단백질 발현에 큰 영향을 미치지 못함이 밝혀졌음. 한편 같은 연구에서 리포터 단백질인 GFP에 동의돌연변이 (Synonymous mutations) 라이브러리를 제작하여 mRNA 2차 구조와 번역 개시율이 유전자의 발현량을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 증명함.
- 위 연구를 토대로 본 연구에서는 목적 단백질인 aprE의 개시 코돈 뒤 11개 아미노산에 동의돌연변이 라이브러리를 제작하였음.
- 탈지유가 포함된 고체 배지에서 다양한 크기의 투명환을 관찰할 수 있었고, 변이체들을 선발하여 단백질 활성을 측정하여 효소 활성이 낮은 균주부터 높은 균주까지 연속적으로 나타나는 것을 확인하였음.
- 이러한 기술을 OPH 발현에 적용하였음. OPH 유전자의 개시 코돈 뒤 11개 아미노산에 동의돌연변이 라이브러리를 제작하고 GFP와 fusion 되게 벡터를 제작하였음. 바실러스에 도입 후 GFP의 발현이 높은 콜로니를 고르고 이 중에서 효소 활성이 높아진 콜로니를 확보하였는데 wild-type 보다 약 6배 이상 효소 활성이 높아진 변이체를 확보하였음.
다. 바실러스 발현시스템을 이용한 여러 효소들의 과발현
(1) multicopy Laccase 과발현 균주 제작
- non-GMO Laccase 과발현 균주에 laccase 또는 개량 laccase 유전자를 하나 더 삽입하여 laccase 활성을 비교하였음.
- 기존 laccase 과발현 균주와 multicopy 과발현 균주의 laccase 활성에 차이가 없는 것으로 보아, 본 연구의 발현 시스템에 의한 laccase 유전자의 발현은 포화 상태로 더 이상의 발현량 증가가 없는 것으로 생각됨.
(2) 농약분해 관여 효소의 과발현
- 생물학적 환경정화를 위한 효소 중 주로 유기 농약 분해에 관여하는 효소로는 Cytochrome P450s, Esterases, Peroxidases, Transferases 등이 있음.
- 지금까지 구축된 바실러스 발현 시스템을 이용하여 이미 과발현시킨 Laccase, OPH 뿐만 아니라, 위의 농약 분해능 유전자들을 발현시키고자 함.
- Cytochrome P450 효소는 대부분의 생물체에 존재하며 매우 다양한 산화반응의 촉매 역할을 하는 효소들로 구성됨. 그 중 세균에서 가장 잘 알려진 바실러스 메가테리움 (B. megaterium) 유래의 P450을 선택하였음,
- 바실러스 메가테리움에는 CYP102 (BM3)와 CYP106 (BM-1) 유전자를 가지고 있음. 각 유전자를 본 연구의 단백질 대량 생산 시스템을 이용하여 과발현하였음.
- 약제 저항성 곤충의 해독효소들 중에서 집파리의 Cytochrome P450 (CYP6A1), 진딧물의 Esterase (E4), 집파리의 Glutathione S-transferase (GST)를 바실러스 서틸리스에 최적화된 코돈으로 바꿔 화학적으로 합성하였음.
- 합성된 유전자들은 바실러스 서틸리스에 도입하였고, 단백질 전기영동을 통해 OPH, CYP6A1을 제외한 나머지 효소들이 과발현됨을 확인하였음.
5. 사과 잔류농약 성분의 분해능 검정
가. 다양한 농약분해효소를 이용한 농약분해능 확인
- 본 연구의 바실러스 발현 시스템을 이용하여 과발현시킨 농약분해능 효소들의 농약 분해 활성을 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 진행함.
- Laccase 과발현 균주와 OPH 과발현 균주의 클로르피리포스 분해능을 LC-MS를 통해 살펴보았음. laccase 과발현 균주와 OPH 과발현 균주에서 클로르피리포스의 피크가 줄어들고, 새로운 피크가 나타났음. 이 새로운 피크는 클로르피리포스가 분해되어 생긴 부산물이라 여겨지며 반응에 사용한 클로르피리포스가 고농도라 클로르피리포스의 피크가 남아있다고 여겨짐.
- 클로티아니딘과 과발현한 농약분해능 후보군들과 섞어 37℃에서 24시간 반응시킨 후 꿀벌부채명나방유충에 처리하여 유충의 사망률을 확인함. OPH, BMC21 (B. megaterium CYP102), GST, Mix (CYP6A1 + E4 + GST) 처리구에서 사망률이 현저하게 줄어들었음.
- 사이퍼메트린에 대해서는 BMC21, OPH, CYP6A1, Mix 처리구에서 유충의 사망률이 줄어들었음.
- 페니트로치온에 대하여 BMC21, CYP6A1, E4, GST, Mix 처리구에서 유충의 사망률이 줄어들었고, OPH 처리구에서 색 변화가 나타나 농약을 분해한 것으로 여겨졌지만, 나방 유충의 사망률은 높게 나타나 OPH에 의한 페니트로치온 분해산물 또한 독성을 나타내는 것으로 생각됨.
- 포스티아제이트에 대해서는 BMC21과 GST 처리구에서 현저하게 유충 사망률이 낮아졌음.
- 메티다치온에 대해서는 OPH와 E4에서 사망률이 낮아졌음.
- 프로클로라츠 살균제로 병원균인 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)가 첨가된 고체 배지 상에서 저해환을 형성함.
- 과발현한 농약분해능 후보군들과 농약을 섞어 병원균이 첨가된 고체 배지에 접종하여 저해환의 크기를 관찰하였음.
- aprN, bioI, E4, lip, nprE 처리구에서 저해환의 크기가 약간 줄어들었고, aprE, BMC21, BMC63 처리구에서는 저해환이 현저하게 줄어들었음.
- LC-MS를 통해 Laccase 과발현 균주의 테부코나졸에 대한 농약분해능을 살펴보았음. Laccase 과발현된 바실러스 서틸리스 168와 1028 균주에서 테부코나졸 피크가 사라지거나 줄어들었음.
- 테부코나졸이 첨가된 CHPYG1 배지에 순수 분리된 Peroxidase를 처리하여 투명환이 형성되는 것을 확인함.
- 병원균이 첨가된 고체 배지에서 OPH, aprN, nprE, BMC21, CYP6A1, E4, GST, Mix (CYP6A1 + E4 + GST)의 처리구에서 저해환이 control에 비해 줄어들었음.
- 결론적으로 BMC21이 다양한 농약에 대한 분해능을 보였고 이를 이용하여 사과의 잔류농약 분해를 시도함.
나. 효소 대량배양 및 시제품 제작
- BMC21 균주를 바실러스 대량배양 배지에서 60시간동안 배양하였음.
- 발현된 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 라이소자임과 계면활성제를 처리하여 세포를 용해시킨 농약분해 활성 검정용 시제품을 제작함.
다. 사과의 잔류농약 분석
- 위에서 준비한 시제품을 사과에서 잔류농약 제거에 이용될 수 있는지 확인하고자 다음과 같은 실험을 진행하였음.
- 시중에서 판매되는 사과에 특정 농약 (실바코 (주성분: 테부코나졸))과 제작된 시제품을 처리하여 잔류농약 검사를 의뢰함.
- 그 결과, 농약만 처리한 사과에서는 테부코나졸 외 3종의 농약이 검출되었지만, 농약과 BMC21를 함께 처리한 사과에서는 어떤 농약성분도 검출되지 않았음.
- 따라서 다양한 농약에 대한 분해능을 가진 BMC21을 필드에 이용하여 친환경적으로 사과의 잔류농약을 제거할 수 있을 것으로 예상됨.
Abstract
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The gross production cost of agricultural crops in South Korea has reached $11 billion, yet poor post-harvest management (PHM) makes almost $3 billion lost every year. Therefore, the role of PHM has increased in agricultural industries in order to maintain the quality of products, keep them from bei
The gross production cost of agricultural crops in South Korea has reached $11 billion, yet poor post-harvest management (PHM) makes almost $3 billion lost every year. Therefore, the role of PHM has increased in agricultural industries in order to maintain the quality of products, keep them from being lost, avoid their decomposition and retain freshness to deliver safe products to consumers. There are several steps in PHM, which includes – cleaning, sorting, quick cooling, storage, transportation and distribution. This project is focused on handling before storage, the pesticide residue control. In case of apple, its export in Korea reached $1000 million in the year of 2010. However, apple exports to Taiwan was temporarily suspended due to the pesticide residue detection and products that do not satisfy export customs clearance procedures were caught in following years. This phenomenon remained a great concern to develop an environmental-friendly method for removal of residual pesticides. Consequently, preventing pesticide residue on agricultural products to meet the standards of any export customs clearance procedures is indispensable. Laccase is an enzyme exists in diverse organisms like higher plants, insects, bacteria. Laccase belongs to a multi-copper oxidase that catalyzes biodegradation of lignin and the oxidation of the other aromatic compounds such as polyphenol and diamine. Also, in the presence of redox mediator, Laccase can catalyze the oxidation of non-phenolic compounds. By considering its characteristic to possess broad substrate spectrum, Laccase is known to degrads various chemical compounds containing imazalil. Recently, a lot of attention has been given to bioremediation of organophosphates and studies have shown that organophosphorus hydrolase (OPH) can detoxify certain pesticides; Parathion, Methyl parathion and Methamidophos. In the same context, cytochrome P450s, esterases, peroxidases and transferases have identified as enzymes that can be used in bioremediation. As a heme monooxygenase, Cytochrome P450s catalyze biodegradation of aromatic and alicyclic compound, whereas the esterases break down the ester bond for detoxification of chemical compounds. Peroxidases destroy aromatic compounds by catalyzing oxidation-reduction reaction when transferases such as Glutathione S-transferase (GST) catalyze dehydrohalogenation of cyclic compounds. The over-expression of these pesticide detoxifying enzymes is a common mechanism by which pests become resistant to pesticides. Therefore, study of the enzymes; cytochrome P450s, esterases, Glutathione s-transferase (GST) may help to identify the most proficient enzyme that can be used in eco-friendly removal of residual pesticides. Esterases hydrolase organophosphorus, carbamates, and pyrathroid pesticides by transferring their ester group into alcohol and acid for lower pesticide toxicity. On the other hand, GSTs, detoxify organophosphorus, organochlorine, and pyrathroid pesticides by catalyzing the conjugation of endogenous xenobiotic alkylating agents and glutathione to excrete them outside the cell. Throughout this project, we obtained diverse gene library for pesticide degradation enzymes and improved existing pesticide degrading enzymes using direct evolution technique. Also, we constructed novel non-GMO Bacillus strain that can over-produce pesticide degrading enzyme to remove pesticide residue on apple eco-friendly. Among different Bacillus strains collected, one of the known pesticide degrade enzyme Laccase was isolated and overexpressed in B. subtilis. The overexpressed B. subtilis Laccase indicated that it has inner cell expression and remain stable at room temperature. Also, its safety has confirmed along with the ability to degrade different types of pesticides. Moreover, organophosphorus hydrolase (OPH) gene islated from Flavobacterium was over-expressed in Bacillus and its ability to degrade pesticide was confirmed as well. Newly designed synthetic gene circuit to develop counter selectable marker made possible to cause site specific mutation on B. subtilis genome without leaving any foreign DNA behind. It was also successful to express cytochrome P450, esterase, and GST in Bacillus, and their pesticide degradation ability was confirmed through bioassay in the presence of Clothianidin, Cypermethrin, Fenitrothion, Methidathion, and Fosthiazate. Further antifungal plate assay with Prochloraz and Tebuconazole assured that BMC21 and GST were effective on degrading most of the pesticides. Finally, Tebuconazole containing pesticide was sprayed on the surface of the apples along with BMC21 enzyme sample, and pesticide residue analysis confirmed that Tebuconazole was not detected with BMC21 enzyme treated apples. Therefore we concluded that products containing BMC21 enzyme is suitable for pesticide degradation on apple exports.
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