보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 산학협력단 Seoul National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-01 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011186 |
과제고유번호 |
1545007360 |
사업명 |
생명산업기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011186 |
초록
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전 세계적으로 건강에 대한 인지도가 상승하고 항생제에 대한 부작용이 나타나면서 친환경적인 건강 보조제로서 프로바이오틱스가 각광을 받고 있다. 2000년대부터 지금까지 국제적으로 프로바이오틱스 시장 규모가 확장되고 있고 소비자의 요구가 반영 되면서 프로바이오틱스를 주도 하던 북미 유럽 국가뿐 아니라 한국을 비롯한 아시아의 시장 규모 역시 지속적으로 성장할 것으로 예상 되고 있다. 프로바이오틱스는 숙주 동물의 장내에 정착하여 여러 가지 대사 활성을 통해 유해균을 억제 하여 균 총을 개선하고 독성물질을 분해하여 에너지원으로 사용 하는 등
전 세계적으로 건강에 대한 인지도가 상승하고 항생제에 대한 부작용이 나타나면서 친환경적인 건강 보조제로서 프로바이오틱스가 각광을 받고 있다. 2000년대부터 지금까지 국제적으로 프로바이오틱스 시장 규모가 확장되고 있고 소비자의 요구가 반영 되면서 프로바이오틱스를 주도 하던 북미 유럽 국가뿐 아니라 한국을 비롯한 아시아의 시장 규모 역시 지속적으로 성장할 것으로 예상 되고 있다. 프로바이오틱스는 숙주 동물의 장내에 정착하여 여러 가지 대사 활성을 통해 유해균을 억제 하여 균 총을 개선하고 독성물질을 분해하여 에너지원으로 사용 하는 등 체내에서 이로운 효과들을 나타내는 미생물들을 통칭하는데 유산균이 대표적인 균주이고 효모 로는 Saccharomyces boulardii가 잘 알려져 있다. 유산균에는 스트웹토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp), 루코노스톡 (Leuconostos sp), 락토바실러스 속(Lactobacillis sp), 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus sp) 및 비피도 박테리움 (Bifidobacterium)등이 있으며 이러한 균들은 장내에서 다양한 대사활성과 항생물질 생산으로 유해균을 억제하고 독성물질 분해로 발생하는 부산물을 에너지원으로 이용한다. 그러나 프로바이오틱스로 이로운 효과를 나타내기 위해서는 장까지 안정적인 이동과 정착 및 증식 할 수 있어야 하는데 실제로 유산균의 경우 내산성, 내 답즙산성 및 장내 정착성이 약하다는 단점이 있기 때문에 관련 분야에서 수 많은 연구가 진행 중에 있다. 또한 항암효과, 면역 활성, 정장, 혈압조절, 및 콜레스테롤 저하등 여러 방면으로 연구가 이루어지고 있다. 최근 유산균의 단점을 보완 할수 있는 천연효모종의 개발로 프로바이오틱스 생균제가 널리 이용되고 있다. Sacccharomyces boulardii는 Sacccharomyces cerecisiae와 유전적 상동성을 갖지만 일반적으로 30℃ 이상에서 기능저하를 나타내는 기존 효모와는 달리 37℃에서 증식이 가능하고 장 정착성에서 우수한 능력을 가지고 있어 전 세계적으로 널리 이용되고 있는 효모종이지만 그 외 다른 대사 및 분해능에 관한 특성 연구는 미진하다. (주)힐링바이오의 SJP 효모로 이루어진 제품들은 현재 양돈장과 양계장에서 사용되고 있으며 악취제거와 생산성 향상 등 뚜렷한 효능을 보이고 있으나 이러한 효능에 대한 과학적 근거가 규명되지 않아 널리 보급하는데 어려움이 있고, 탁월한 효능에도 불구하고 해외 수출에 어려움을 겪고 있어 이에 대한 기초연구를 수행하였다.
1. 신종효모의 특성분석
가. 신종효모 유전자 분석
18S rRNA gene full sequence 비교 결과 SJP, CIP 및 exiguus는 모두 cerevisiae와 1개의 염기서열 차이(T1300C)를 가지고 있다. SJP와 CIP의 5.8S rRNA gene 염기서열을 Kazachstania exigua 및 cerevisiae와 비교한 결과 SJP는 11개 염기서열 차이를 기존 알려진 효모와는 차이를 보였고, CIP는 2개 염기서열 차이를 보였으나 CIP의 경우 Vanderwaltozyma tropicalis 및 S. servazzii와 100% 동일한 염기서열을 보였다.
Internal transcribed spacer (ITS) 염기서열 분석을 위해 프라이머를 설계하여 PCR을 수행한 결과 증폭산물의 크기의 차이를 확인하였고, 염기서열 분석 결과 다양한 염기서열의 차이와 함께 염기서열 결손이 관찰되어 비교한 효모와 CIP 및 SJP는 뚜렷한 차이를 보임을 재확인 하였다.
나. 게놈 분석
SJP와 CIP는 NGS system을 통하여 de novo sequencing을 실시하였고 그 결과를 토대로 Genome-assemble과 Re-sequencing을 실시하였다. SJP의 유전자 contig는 총8466개로 사이즈는 다양하게 나타났고 NCBI-BlastX를 통해 가장 가까운 효모주를 선별하여 sequenclng의 reference로 사용하였다.
SJP는 reference(Pichia kudriavzevii-SD108, Biosample: SAMN02952138) 대비 10Mb당 평균 coverage는 97.44%로 나타났고 그중 mapped read는 평균 94.77%로 나타났다. 전체 mapping 유전자중 총 46,719개의 site에서 유전자 삽입, 결손 및 치환의 결과가 나타났다. Matching sequence 중 0.37052402434 %의 차이를 보여 Pichia kudriavzevii와의 차이를 확인하였다.
다. 대사관련 유전자 분석
SJP의 대사 관련 유전자들의 증폭여부와 염기서열의 BLAST 검색 결과를 아래 그림과 표에 정리함. SJP는 14개 대사 유전자들 중 10개가 증폭되었고, 염기서열 분석 결과 각 대사유전자에 특이적 [Iane 4, Glycerol 3-phosphate dehydrogenase NAD+ (GPD)는 증폭되었으나 비특이]이었으며 kudriavzevii와 6개 유전자 (98-100%), 와 4개 유전자 (84-99%), orientalis와 2개 유전자(99, 100%) 에서 가장 높은 상동성을 보여 유전자들의 모자이크 특성 (mosaicism) 이 뚜렷하여 SJP가 기존 효모와 차별화 되는 효모임을 재확인 하였다.
라. 유용유전자 발굴
NCBI gene bank DATA base에서 Yeast URA3를 참고로 약 20개의 URA3 유전자 프라이머 설계하여 SJP와 CIP에서 DNA를 추출하여 하여 확인된 밴드를 cloning하였고, 염기서열을 확인 하였다.
SJP orotidine 5-phosphate decarboxylase (URA3) 유전자 클로닝 (Pichia kudriavzevii의 URA3 유전자와 100% 일치하는 것을 확인하였고, 생명공학연구원 유전자원센터에 유전자원 등록 하였다.
마. 프로테옴 분석
S. cerevisiae (KCTC 50757), CIP, SJP에서 추출한 단백질을 2D-GE(pH3-10, 8-16% gel, 수행한 결과 진하게 나타나는 주요 spots에서 상당히 다른 차이를 보여주고 있어 CIP와 SJP의 프로테옴은 S. cerevisiae 뿐 아니라 서로 큰 차이가 있다.
다양한 등전점(pI)과 분자량을 갖는 25개의 spot(위의 그림 14)을 Gel에서 추출한 후 trypsin 처리하여 얻어진 펩티드의 분자량을 측정하여 데이터베이스의 단백질과 일치여부를 확인하여 관련성이 높은 단백질(matched protein)을 예측하였다. 실제 spot의 분자량과 관련성이 높은 단백질의 분자량을 아래 표에 비교하였다. SJP의 경우 spot 1-6, 10-13, 18, 20, 23의 경우 일치하는 단백질을 찾을 수 없어 기존 효모의 단백질과 상당한 차이를 가지고 있는 것으로 판단하였다. 그러나 나머지 spot의 경우도 실측 분자량과 예상 분자량 및 등전점의 차이가 커 신뢰도는 낮으므로 SJP는 기존 효모와 상당한 차이를 보이는 것으로 판단하였다.
2. 신종효모 쟁균제 효능 평가
가. 배양 형태 및 배양성
SJP와 CIP의 집락 형태를 37℃에서 비교한 결과 SJP는 CIP 대비 크고 불투명한 백색 집락을 형성 하였으나 CIP는 상대적으로 작고 광택이 나는 백색의 집락을 형성하였다. SJP와 다른 Saccharomyces exiguus 표준 균주 (KCTC 7169, KCTC 17660)의 배양 온도 비교-SJP는 개발 당시 동정 기술의 한계로 선종 효모이나 S. exiguus와 유사한 효모로 분류 되었으나 SJP는 37℃에서 증식성이 탁월하지만 S. exiguus는 증식성이 매우 낮아 뚜렷한 차이를 보였다. SJP와 다른 Saccharomyces boulardi(균주 분양기관)의 37℃ 배양성 비교 (SJP와 S. boulardii를 YMA에 streaking하여 37℃에서 배양성을 비교한 결과 SJP는 18h만에 매우 활발한 성장을 보였고 S. boulardii는 18h 배양에서 집락을 형성하지 못하였고 24h의 추가 배양시간 후 집락을 형성하여 다시 24h의 추가 배양 후 SJP의 집락과 유사한 크기로 성장하여 SJP가 S. boulardii보다 37℃ 배양에서 빠르고 높은 증식을 보였다.
나. 내열성 시험
CIP(C), SJP(S), S. cerevisiae (KCTC 50757), S. boulardii(B; S. cerevisiae와 게놈 서열상 99% 유사하나 37℃ 증식성을 보유함)를 55, 60, 65℃에서 10분간 열처리 한 후 YMA에 도말하여 37℃에서 배양하여 생존여부를 확인한 결과 모두 60℃에서 생존하였으나 65℃에서는 SJP만 생존하여 뚜렷한 차이를 보였다.
다. 장 정착성 시험
1) 1차 실험에서 맹장변 그람당 SJP는 1.3x104-7.5x105cfu, CIP는 6.6x103-3.4x105cfu가 분리되었으나 대조군과 S. cerevisiae는 분리되지 않아 CIP와 SJP의 위산, 답즙, 및 장내 증식성이 확인되었다.
2) 2차 실험에서는 대조군과 S. cerevisiae 투여군은 효모가 전혀 분리되지 않았지만 맹장변 그람당 CIP는 2.4x104cfu/g, SJP는 3.8x105cfu/g이 분리되었다. 담즙염이 포함되어 있는 MacConkey Agar에 SJP와 S. boulardii를 도말하여 37℃에서 배양하여 생존 여부를 확인한 결과 SJP는 3일째 매우 작은 집락을 형성하였고 4-5일째 육안으로도 확인이 가능한 집락의 크기로 성장한 반면 S. boulardii는 같은 기간 동안 집락을 전혀 형성하지 않았다
라. 항균제 및 항진균제 감수성 조사
항균제-ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, amikacin, chloramphenicol, ciprofloxacin, doxycycline, gentamicin, kanamycin, neomycin, norfoxacin, penicillin, streptomycin, sulfamethoxazole/ trimethoprim, tetracycline, enrofloxacin, ceftiofur, florfenicol, lincomycin, oxytetracycline, spectinomycin에 모두 내성이 있음을 확인하였다. (disk diffusion test)
항진균제-nystatin(O.625ug/ml), amphotericin B (0.156ug/ml)
마. 병원성
SJP 계태아 섬유아세포 (CEF) 접종 시험 SJP 배양액(24h)을 100배 희석하여 CEF에 접종하였고, 5일 후 관찰한 결과 세포는 세포변성효과를 보이지 않았다. 종란 접종 결과 107cfu/ml을 SPF종란에 0.1ml/개씩 접종한 후 60시간 배양하여 chilling하여 종란의 생존 및 계태아의 병변을 관찰한 결과 SJP/CIP 접종군 모두 60시간동안 생존하였으며, 계태아 역시 Control과 큰 차이를 보이지 않아 계태아에 대한 병원성이 없었다.
바. 유용유전자 발현용 영양요구주 (auxotroph)제작
SJP배양액을 10진 희석하여 1O-3 - 1O-4cfu/ml의 희석배율을 YMA에 도말하여 37℃에서 배양 후 집락이 고르게 형성되면 UV 조사기(높이 -35cm) 안에서 15분간 UV mutagenesis를 실시 후 모든 colony를 수거하여 PBS에 부유시켰다. UV 처리된 SJP 부유액을 10진 희석하여 YMA에 도말후 37℃에서 배양하여 집락이 100개 이하로 형성된 희석배율을 선정, replica를 이용하여 최소결손배지에 동일한 colony를 접종한 후 다시 37℃에서 배양한 결과 7종의 결손배지 중 adenine결손 배지에서 colony를 형성하지 않았고 UV mutagenesis 에 의해 SJP의 adenine 생합성 관련 유전자들에 돌연변이가 있을 것으로 판단되었다.
사. 담즙염 내생 변이주 개발
SJP 배양액 103-104 cfu/ml를 Bile salt 0.15%가 함유된 YM Broth에 접종하여 37℃에서 3일간 배양하였고 다시 10진 희석 하여 같은 방법으로 두 가지 액체배지에 103-104 cfu/ml씩을 접종하여 37℃에서 1일 배양하였다. 이후 계대 배양에서는 1일을 기준으로 배양하였고 19대까지 연속 계대배양 하여 최종적으로 BT-SJP변이주를 선발하였다. BT-SJP담즙 내성 균주와 SJP모균주는 0.15% 담즙염이 함유된 YM Broth에 각각 접종하여 2시간 간격으로 배양액을 수거하여 YM agar에 도말하였고 37℃에서 배양하여 colony수를 측정한 결과 BT-SJP는 4시간 이후부터 모균주 대비 높은 증식성을 나타내었고 담즙에 대한 내성을 확인하였다.
아. 저가 배양배지 조성
사료첨가제용 효모 배지를 당밀에서 미강으로 변경하여 효모 배지의 원가를 약 70% 낮췄으며, 당밀배지에 비해 미강배지에서의 효모 최대 성장이 약 10배 증가하였고, 기존 사료첨가제보다 효모균수가 약 7-10배 증가한 사료첨가제를 생산함으로 인해 효율 증대시켰다. 저온에서의 미강추출 시 종전보다 영양성분에서의 우위를 점하여 기존 미강배지에 비해 효모의 균수가 약 5배 증가하였다.
이러한 연구결과들은 (주)힐링바이오 효모제품의 효능 기전을 이해하는데 도움이 되며 현장에서는 가금의 소화효율 증진, 생산성 향상 및 분뇨 악취 저감을 통한 생산성 향상에 기여할 것으로 판단된다. 또한 본 연구 과제를 통해 개발한 아데닌 영양요구주는 유용한 외부유전자 발현을 위한 벡터로 활용할 수 있으며 담즙염 내성주는 생균제로 활용 가능할 것으로 기대된다.
Abstract
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With rising awareness of the health worldwide, the probiotics as health supplements are getting the attention, fearing the side effect of antibiotics. From 2000s to date, probiotics market expansion reflected by demand of consumers is leading to development of international market in North America a
With rising awareness of the health worldwide, the probiotics as health supplements are getting the attention, fearing the side effect of antibiotics. From 2000s to date, probiotics market expansion reflected by demand of consumers is leading to development of international market in North America and Europe, as well as Asian countries, including Korea. The world market size of probiotics was $15.9 billion in 2008, it was one of big emerging markets expected to reach $28.8 billion.
Probiotics are live microorganisms which confer benefit on the host. Most of probiotics are bacteria, containing Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostos, and Bifidobacterium. These bacteria can improve the trait of microbiota in gastrointestinal tract of host through various metabolic activity and toxic material decomposition. However, probiotic bacteria are susceptible to gastric acid, bile salt and uneasy to settle down in GI tract. Yeast has been used as a protein and vitamin sources in feed and Saccharomyces cerevisiae has been used as a probiotics. The optimal growth temperature of S. cerevisiae is 28-30℃ and it can not metabolize properly at body temperatures (37-41℃) of animals. For this reason thermophilic yeast such as S. boulardii has been used as a probiotics especially for prevention of diarrhea in humans.
The Healing-Bio Co. Ltd. developed commercial probiotics which have been used in pig and poultry farms and the probiotics was evaluated to be efficacious for removing odors of ammonia and H2S, and productivity improvement. Therefore, in the present research work we characterized two yeast strains (SJP and CIP) contained in the probiotics product to understand the mechanisms of their efficacy.
The SJP strain was identified as Pichia kudriavzevii on the basis of genome analysis but it possessed many single nucleotide polymorphisms. SJP grew rapidly at 37℃ and resistant to heat shock at 65℃. SJP grew on MacConkey agar which contained bile salt and 1.3x104-7.5x105cfu of SJP were present in one gram of cecal feces. The presence of many SJP in the cecal feces may support gastric acid and bile salt tolerance and successful settle-down in the intestine. Co-culture of SJP with H2S-producing Salmonella Enteritidis in TSI agar slant decreased the agar media discoloration which was caused by H2S. SJP was non-pathogenic in SPF embryos and immunocompromised chickens when SJP was inoculated with more than 107cfu of SJP via allantoic cavity and intravenous routes. respectively. SJP was resistant to most of antibiotics against procaryotes. We established an adenine auxotroph and a bile salt-tolerant mutant of SJP.
The CIP strain was not completely identified yet but it seemed to be novel on the basis of proteome and ribosomal sequence analyses. ClP grew rapidly at 37℃ and resistant to heat shock at 6O℃. CIP did not grow on MacConkey agar which contained bile salt but 6.6x103-3.4x105cfu of CIP were present in one gram of cecal feces. The presence of many CIP in the cecal feces may support gastric acid and bile salt tolerance and successful settle-down in the intestine. Co-culture of CIP with H2S-producing Salmonella Enteritidis in TSI agar slant decreased the agar media discoloration which was caused by H2S. CIP was non-pathogenic in SPF embryos and chickens when CIP was inoculated with more than 107cfu of CIP via allantoic cavity and intravenous routes. respectively.
In conclusion, the efficacy of probiotics product of the Healing-Bio Co. Ltd. can be explained by effective settle-down of yeasts in the intestine, active metabolism at the body temperature and capability to decompose ammoma and H2S. The non-pathogenicity in chicken embryos and immunocompromised chickens may support biosafety of SJP and CIP strains, and the adenine auxotroph of SJP may be valuable as a shuttle vector which express various functional proteins such as lysins and protective antigens.
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