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Kafe 바로가기주관연구기관 | 한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2014-11 |
과제시작연도 | 2013 |
주관부처 | 농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 | TRKO201500011248 |
과제고유번호 | 1545006410 |
사업명 | 생명산업기술개발 |
DB 구축일자 | 2015-07-18 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201500011248 |
○ Cyclic lipopeptide의 생산능이 증대된 길항 미생물 Bacillus의 개발 및 산업화
Ⅳ. 연구개발 결과
1). 자외선 조사를 통한 iturin 高生産 돌연변이주의 확보
야생주 B. subtilis subsp. krictiensis로부터 유래된 자외선 돌연변이주 M1891과 UV4-II 균주를 이용하여 더욱 더 iturin 생산능이 증대된 돌연변이주를 얻기 위하여 2.80 mW/cm2로 자외선을 처리하고 0.1% 이내의 생존율을 나타내는 적정 처리 시간을 조사하여 B. subtilis subs
○ Cyclic lipopeptide의 생산능이 증대된 길항 미생물 Bacillus의 개발 및 산업화
Ⅳ. 연구개발 결과
1). 자외선 조사를 통한 iturin 高生産 돌연변이주의 확보
야생주 B. subtilis subsp. krictiensis로부터 유래된 자외선 돌연변이주 M1891과 UV4-II 균주를 이용하여 더욱 더 iturin 생산능이 증대된 돌연변이주를 얻기 위하여 2.80 mW/cm2로 자외선을 처리하고 0.1% 이내의 생존율을 나타내는 적정 처리 시간을 조사하여 B. subtilis subsp. krictiensis M1891는 25분, UV4-II 균주는 30분으로 정하였다. Iturin 생합성능이 증대된 자외선 돌연변이주를 선발하기 위하여 자외선으로 처리한 B. subtilis subsp. krictiensis M1891과 UV4-II 균주 현탁액을 평판 배지에 도말하고 평판 위에 F. oxysporum 현탁액이 함유된 soft agar를 분주하고 25℃ 에서 배양하여, 변이주 30,000여종의 집락으로부터 자외선으로 처리하기 전의 모 균주보다 2-3배 항균력이 증대된 자외선 돌연변이주 No. 54를 선발하였다.
2). 상업적인 제품에 활용되고 있는 Bacillus 균주와 iturin 高生産 돌연변이주의 항균 활성 비교
자외선 돌연변이주 B. subtilis subsp. krictiensis No. 54 균주의 항균력과 상업적으로 사용되고 있는 제품 (Serenade 2종, 에코제트 1종, Kodiak 1종)으로부터 분리한 B. subtilis 균주들과의 항균력을 비교하였다. 분리한 각각의 균주를 iturin 생산배지를 이용하여 30℃에서 72시간 동안 진탕배양하고 여과한 상등액을 F. oxysporum이 함유된 평판을 이용하여 활성검정을 행한 결과 선발한 No. 54 돌연변이주가 다른 기존 제품에 사용된 균주보다 더 강한 저해 활성을 나타내어, 이 균주를 B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 균주로 명명하였다.
3). 야생주 B. subtilis subsp. krictiensis 균주로부터 얻은 iturin 생합성 유전자의 염기서열결정과 2차 대사산물의 분석
이전 연구를 통해 야생주 B. subtilis subsp. krictiensis ATCC55079의 genomic library로부터 염기서열 결정을 통해 6개의 ORF로 구성되어 있는 37,645 bp의 iturin 생합성 유전자를 확보하고 GenBank에 기탁하였다 (GenBank accession No. KC454625). 이 유전자 가운데 ORF3에 해당되는 중간 부위에 mini-Tn10 transposon이 삽입된 mutant-10 돌연변이주는 야생주에 비해 iturin 생합성이 현저하게 감소한 것을 HPLC를 통해 확인하였으며, 또한 야생주는 6 종류의 iturin (iturin A~F)을 생산하는 것을 LC-MS를 통해 재확인하였다. 야생주로부터 얻은 iturin 생합성 유전자의 각 ORF들을 최근의 database를 이용하여 비교해 본 결과 ORF2~ ORF5은 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum 균주의 surfactin synthetase 유전자들과 99%로 상동성을 나타내었다. 비록 야생주의 ORF들이 B. amyloliquefaciens 균주의 surfactin synthetase들과 높은 상동성을 나타내었으나, ORF3에 mini-Tn10을 삽입하여 얻은 iturin-less 돌연변이주에서는 야생주에 비해 iturin의 생성능이 30% 정도 감소하였고, LC-MS를 통해서도 야생주는 6종류의 iturin을 생성하는 것을 재확인하였기 때문에 야생주로부터 얻은 생합성 유전자는 itutin 생합성 유전자로 추정되었다. 야생주 B. subtilis subsp. krictiensis 균주와 mutant-10 균주가 iturin 이외에 다른 cyclic lipopeptide를 생산하는지의 여부를 HPLC와 LC-MS를 이용하여 조사한 결과 야생주와 mutant-10 균주 모두에서 iturin 이외에 소량의 surfactin도 함께 생산한다는 것을 알 수 있었으나 생산량은 iturin에 비해 매우 미약하였다. 또한 mini-Tn10 유래의 spectinomycin 저항성 유전자가 삽입되어 야생주보다 iturin 생산량이 30% 감소된 mutant-10 돌연변이주에서는 검출된 surfactin 양이 야생주보다 오히려 2배 정도 더 많이 검출되었다. 이러한 결과들을 종합해볼 때 비록 야생주로 부터 얻은 iturin 생합성 유전자가 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum의 surfactin synthetase 유전자와 높은 상동성을 나타내었으나, 이 유전자는 surfactin 생합성 유전자가 아니고 iturin 생합성 유전자로 사료되었다.
4). Iturin 高生産돌연변이주를 이용한 iturin 생합성 관련 유전자 변이 조사
Iturin 생산능이 증대된 B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 돌연변이주를 이용하여 야생주보다 항균활성이 증진된 원인을 분자수준에서 규명하기 위하여, Next Generation Sequencing (NGS)을 실시하고, 야생주의 iturin 생합성 유전자 37,645 bp와 비교하여 돌연변이가 일어난 부위를 비교분석하였다. 자외선 돌연변이주 BSM54에서는 iturin 생합성 유전자 중 6곳에서 야생주와 다른 point mutation을 발견하였는데, ORF1 upstream에서 1곳 (M1), ORF2 부위에서 5곳 (M2-M6) 등 모두 6 부위에서 다른 염기로 치환된 것을 알 수 있었다. 또한 돌연변이가 일어난 6곳 중 ORF1의 upstream region에 나타난 M1 point mutation은 돌연변이가 일어난 부분의 mRNA secondary structure에 변화를 가져올 것으로 예측되었다. 이러한 결과로 부터 M1 point mutation은 ORF 앞쪽 promotor에 대한 변화로써 transcription단계에서 iturin 생합성에 영향을 나타낼 가능성이 있는 반면에 M3 point mutation은 translation후 얻은 최종 유전자 산물에 따른 phenotype의 변화로 나타날 가능성이 있을 것으로 예상되었다.
5). Iturin 高生産 자외선 돌연변이주 B. subtilis BSM54의 point mutation에 따른 iturin 생합성 유전자의 발현 양상 비교 분석
자외선 조사를 통해 얻은 iturin 高生産돌연변이주 B. subtilis BSM54를 이용하여 iturin 생합성 관련 유전자 ORF1부터 ORF5까지 각 ORF들의 발현양이 증가하였는지의 여부를 야생주와 비교하였다. 먼저 돌연변이주 B. subtilis BSM54와 야생주 B. subtilis를 LB 배지를 이용하여 30℃에서 24, 48 및 72시간 간격으로 배양하여 얻은 total RNA를 분리정제하고, cDNA를 합성한 후 real-time PCR을 행하였다. 그 결과 자외선 돌연변이주 BSM54의 ORF2~ORF5의 발현량은 48시간 이후 야생주와 비교해볼 때 상대적으로 더 증가하였으며, 특히 ORF2~4에서는 매우 커다란 차이를 나타내어, iturin 高生産돌연변이주 BSM54는 point mutation에 의한 유전자의 변이로 iturin 생합성에 관련된 유전자들이 모두 야생주보다 그 발현량이 증대됨을 알 수 있었다.
6). Iturin 高生産돌연변이주 B. subtilis BSM54의 Botrytis cinerea에 대한 포자 발아 억제 효과
자외선 돌연변이주 B. subtilis BSM54와 야생주 B. subtilis를 iturin 생산배지에서 3일 동안 배양하여 염산으로 처리하고 생성된 침전물을 중화시킨 후 다시 butanol로 처리하여 얻은 butanol 분획물을 감압 농축하였다. 포자 발아를 억제하는지를 조사하기 위하여 잿빛곰팡이병 원인균인 Botrytis cinerea의 포자를 106 spores/ml가 되도록 현탁하고, butanol 분획물을 각각 125~500 μg/ml가 되도록 첨가하여 hole slide glass를 이용하여 25℃에서 6시간동안 배양한 후 현미경으로 포자 발아 유무를 관찰하였다. 동일한 농도인 125 μg/ml의 butanol 분획물 처리구에서는 돌연변이주 BSM54와 야생주간에 B. cinerea의 포자 발아 억제에 커다란 차이를 나타내지 않았으나 250 μg/ml의 butanol 분획물 처리 시에는 돌연변이주 BSM54가 야생주에 비해 2배 이상 더 강하게 포자 발아를 억제하였다. 특히 500 μg/ml 처리 시에는 야생주에서는 43.5%의 포자 발아 억제율을 나타낸 반면 BSM54 균주에서는 포자 발아가 전혀 일어나지 않아, 250 μg/ml 이상의 동일 농도에서는 돌연변이주 BSM54가 야생주보다 B. cinerea의 포자 발아를 더 강하게 억제하였다.
7). 자외선 돌연변이주 B. subtilis BSM54의 장기 보존에 따른 항균력 변화 가능성 조사
Iturin 高生産자외선 돌연변이주 BSM54를 보존하는 동안 돌연변이가 일어나기 전의 상태인 revertant로 복귀하는 지의 여부를 조사하기 위하여 자외선 돌연변이주 BSM54를 glycerol에 stock하여 –70℃ 냉동고에 보존하면서 2개월 이후부터 1개월 간격으로 최대 2년까지 저장 기간에 따른 항균력의 변화를 F. oxysporum에 대한 생육 저지환의 크기로 측정하고 야생주와 비교하였다. 자외선 돌연변이주 BSM54의 항균력은 저장 기간에 따라 다소 항균력에 근소한 차이를 나타내었으나, 전반적으로 보관 2개월부터 2년까지의 기간 동안 항균력에 커다란 차이를 나타내지 않았다.
8). Iturin 高生産돌연변이주 B. subtilis BSM54와 야생주의 iturin 생산능 비교
야생주 B. subtilis와 돌연변이주 B. subtilis BSM54의 butanol 추출물을 감압 농축하여 얻은 butanol 분획물에 함유되어 있는 iturin 화합물의 생산능을 HPLC와 authentic iturin A 화합물을 이용하여 비교 분석하였다. 야생주와 돌연변이주 BSM54의 butanol 분획물의 HPLC 크로마토그램으로부터 iturin 생산능을 정량적으로 분석한 결과 야생주와 돌연변이주는 butanol 분획물 가운데 iturin이 각각 4.175%와 8.716%로 나타나 동일 조건에서 돌연변이 주 BSM54로부터 생산된 iturin의 양이 야생주보다 약 2배 더 증가하였다.
9). Site-directed mutagenesis용 형질전환 벡터의 제조
야생주 B. subtilis에 자외선 돌연변이주 M1 point mutation 대상 부위를 포함하는 ORF1 region을 클로닝하기 위해 primer ORF1_u-f (5′-TAATCGCCGTCAGTTCCTCG-3′)와 ORF2-r (5′-TTCTCATCGACTCATACCGC-3′) 및 Accu Power Pfu PCR Premix를 사용하여 약 1.8 kb의 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물과 pUC19 vector를 모두 EcoRI으로 절단한 후 4℃에서 16시간 ligation 반응을 실시하고 E. coli DH5α competent cell에 형질전환 하였다. 이렇게 얻은 pBSM54-orf1을 다시 BamHI과 XbaI으로 double digestion하고, pIC333으로 부터 위와 동일한 제한효소 처리로 얻어진 spectinomycin resistance gene cassette을 ligation하여 pBSM5-orf1-sp 형질전환 벡터를 제조하였다.
10). 분자수준에서 돌연변이가 일어난 iturin 생합성 유전자와 site-directed mutagenesis를 이용한 야생주 B. subtilis 균주의 개량
Iturin 高生産돌연변이주인 BSM54의 iturin 생합성능을 더욱 더 증진시키기 위하여 point mutation이 일어난 6곳의 site 가운데 아미노산 치환이 일어나지 않은 부위 중 먼저 iturin 생산에 영향을 미칠것으로 예상되는 M1 point mutation 부위의 염기를 대상으로 site-directed mutagenesis를 시도하였다. 앞서 proofreading DNA polymerase를 이용한 PCR로 얻은 M1 point mutation site를 포함한 ORF1유전자 부위와 QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit 및 mutagenic primer들을 이용하여 site-directed mutagenesis를 위한 형질전환 벡터 pBSM54-orf1-sp-1을 최종적으로 제조하였다. 야생주 B. subtilis 균주를 site-directed mutagenesis를 이용하여 형질전환하기 위하여 야생주를 modified Spizizen 배지에 배양하고, 580 nm에서 흡광도가 1.0일 때 배양액과 형질전환벡터 pBSM54orf1-sp-1을 혼합하고, 60 μg/ml의 spectinomycin이 첨가된 LB 배지에 도말하여 생육한 집락들을 1차 선발하였다. 또한 선별한 집락을 대상으로 형질전환 유무를 확인하기 위하여 orf1-f3, spcf1, spc-f2, hxlr1 및 hxl-r2 primer들을 이용하여 PCR을 수행하고 대조구와 동일한 크기의 PCR 산물이 검출된 저항성 집락들을 먼저 선별하였다. 선발된 형질전환주의 단일 집락들을 iturin 생산배지에 배양하고 얻은 상등액을 F. oxysporum이 함유된 검정용평판배지에서 활성검정을 행한 결과 형질전환주 T1과 T6는 야생주보다 F. oxysporum 균주를 이용한 활성검정 시 생육 저지환의 크기가 더 증가하였다. 한편 야생주와 형질전환주 T1 및 T6로부터 생산된 iturin을 정량적으로 비교하기 위하여 각 균주를 30℃에서 3일간 배양하고 얻은 상등액의 부탄올 추출물을 HPLC로 분석한 결과 site-directed mutagenesis를 통해 얻은 형질전환주 T1과 T6의 iturin 생산능이 야생주보다 각각 16%와 22% 더 증가하였다.
○ Cyclic lipopeptide 高生産 길항미생물 Bacillus의 대량 배양 및 산업화에 관한 연구
Ⅳ. 연구개발 결과
1. 미생물 살균제의 산업화 및 제품화를 위해 최소 탄소원 및 질소원, 미량원소 조성비설계, Pilot (50 liter, 500 liter)규모 및 5,000 liter 산업화 규모 대량 배양공정 설계, 동결건조 공정 설계, 최적 동결 부재 및 수화제형 개발 완료, 상온 경시 2년 이상 확보 및 이화학성이 양호하였다.
2. 잿빛곰팡이병, 균핵병, 풋마름병 및 시들음병 등에 대한 실내 시험을 완료하였고, 토양 병해에 대한 약효시험결과 방제가가 60% 이상을 나타내었다.
3. B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 균주의 여러 식물병 (풋마름병, 시들음병, 잿빛 곰팡이병)에 대한 활성을 조사하였으며, 배양조건 확립, 처리방법 개발, 작용기작 규명등에 대한 연구를 진행하였다.
4. 본 연구를 통하여 개발된 B. subtilis subsp. krictiensis BSM54는 친환경유기농업자재등록을 하기 위한 일련의 독성시험을 진행한 결과 독성시험에 적용한 B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 AS(액상제)는 모든 시험에서 안전한 물질로 규명되었다.
○ Development and industrialization of antagonistic microorganism Bacillus to enhance the productivity of cyclic lipopeptide
Ⅳ. Results
1. Establishment of iturin high-yielding mutant by UV irradiation
To obtain the UV mutant with increased iturin production by using the UV mutant M1891
○ Development and industrialization of antagonistic microorganism Bacillus to enhance the productivity of cyclic lipopeptide
Ⅳ. Results
1. Establishment of iturin high-yielding mutant by UV irradiation
To obtain the UV mutant with increased iturin production by using the UV mutant M1891 and UV4-II derived from wild-type Bacillus subtilis subsp. krictiensis, ultraviolet ray was irradiated with 2.80 mW/cm2 and the optimal treatment time of ultraviolet ray that showed the 0.1% survival rate was examined. The treatment times of B. subtilis subsp. krictiensis M1891 and UV4-II strains were determined as 25 min and 30 min, respectively. To select the iturin high-yielding UV mutants from these two strains, the culture broths of M1891 and UV4-II strains were spreaded and grown on LB plate and overlayed with the soft agar containing Fusarium oxysporum, and then incubated at 25℃ for 2 days. A UV transformant BSM54 was selected from the colonies of 30,000 transformants which showed 2-3 fold increased antifungal activity over that of mother strains.
2. Comparison of antifungal activities between commercial products and UV mutants producing iturin
The antifungal activity of UV mutant B. subtilis subsp. krictiensis No.54 was compared with that of the B. subtilis strains isolated from commercial products. The isolated strains were cultivated in the iturin production medium at 30℃ for 72 hrs using a rotary shaker and filtered. The supernatants were used in bioassays against F. oxysporum. The mutant No. 54 showed a stronger inhibitory activity than commercial products and it was designated as B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 strain.
3. Sequence determination of iturin biosynthesis genes obtained from wild-type Bacillus subtilis and the analysis of second metabolites
The iturin biosynthesis genes, which are consisted of six ORFs and 37,645-bp sequence in length, determined by sequence analysis from the genomic library of B. susbtilis subsp. krictiensis ATCC55079 in previous study were obtained and deposited in GenBank under assession number KC454625. The mutant-10 strain in which mini-Tn10 transposon was inserted into the ORF3 of iturin biosynthesis gene exhibited markedly lower antifungal activity against F. oxysporum than the wild-type strain on HPLC analysis. The wild-type strain-specific iturin A-F peaks were reconfirmed on LC-MS analysis. Each ORF of the iturin biosynthesis gene obtained from wild-type strain was compared with the database published recently. The iturin biosynthesis genes from ORF2 to ORF5 showed 99% homologies with the surfactin synthetase genes of B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946 strain. Even though these ORFs showed a high similarity to the surfactin synthase genes of B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, the iturin-less mutant, which has a disrupted putative iturin biosynthesis gene, exhibited about 30% decrease in iturin production. In addition, the wild-type strain-specific iturin A-F peaks were detected on LC-MS analysis. From these results, the putative iturin biosynthesis genes obtained from the wild-type strain were thought to be iturin biosynthesis genes. To check the possibility that the wild-type and the mutant-10 strains might produce any other cyclic lipopeptides, the second metabolites of these two strains were also analyzed by HPLC and LC-MS. Although several surfactin peaks on HPLC analysis were detected in both the wild-type and mutant-10 strains, the amounts of surfactin produced were quiet less than that of iturin. Notably the surfactin produced by the mutant-10 strain, which showed 30% decrease in iturin production over wild-type strain, was two-fold greater than that of the wild-type strain. These results suggested that the gene clusters identified in the genome of wild-type B. subtilis subsp. krictiensis are involved in iturin, but not surfactin biosynthesis, even though these genes showed high similarities to the surfactin synthase genes of B. amyloliquefaciens subsp. plantarum.
4. Identification of gene mutation associated with iturin biosynthesis from iturin high-yielding mutant B. subtilis BSM54
To examine the cause of increased antifungal activity in the iturin high-yielding UV mutant BSM54 strain on the molecular level, NGS sequencing for the iturin biosynthesis genes o mutant strain was performed and the mutation sites were identified by comparing with the 37,645-bp sequences of iturin biosynthesis genes from the wild-type strain. Six types of point mutations in the iturin biosynthesis genes of the mutant BSM54 strain were found. One point mutation (M1) was detected in the upstream region of ORF1 and 5 other mutations were noted in the ORF2 region (M2 - M6). Among them, the M1 point mutation found in the upstream region of the ORF1 was predicted to cause the change of mRNA secondary structure. The M1 point mutation, which is located in the promotor in front of ORF, was expected to have the influence on iturin biosynthesis at the transcription stage, whereas M3 point mutation was likely to be responsible for the change of phenotype in accordance with final gene products obtained after translation.
5. Comparison of the expression levels of iturin biosynthesis genes associated with point mutation from iturin high-yielding mutant B. subtilis BSM54
To investigate whether the changes in the expression of each ORF had occurred, the expression levels of ORF1 to ORF5 associated with itrin biosynthesis from iturin high-yielding UV mutant BSM54 were compared with those of the wild-type strain. Total RNAs of mutant BSM54 and wild-type strains were isolated after cultivating at 30℃ for 24, 48, and 72 hrs in LB broth. The real-time PCRs of cDNAs synthesized with purified RNAs were performed. The expression levels from ORF2 to ORF5 in UV mutant BSM54 strain were significantly increased over that of the wild-type strain after 48 hrs. Especially, the remarkable differences of expression levels between mutant BSM54 and wild-type strains were observed in the ORF2 to ORF4. The increased expressions of mutant BSM54 strain were found to be due to the point mutations of genes associated with iturin biosynthesis.
6. Suppressive effects of iturin high-yielding mutant B. subtilis BSM54 on spore germination of Botrytis cinerea
The suppressive effects of UV mutant BSM54 and wild-type strains on the spore germination of Botrytis cinerea were examined as follows. The culture broths cultivated for 3 days were precipitated with hydrochloride, neutralized, fractionated with butanol, and then evaporated in vacuo. The spore concentration of B. cinerea, the causative agent of cucumber gray mold, was adjusted to reach 106 spores/ml and aliquots of the butanol fractions were added into each hole slide glass to be in a range of 125-500 μg/ml. The slide glasses were incubated at 25℃ for 6 hrs and the spore germination rates were observed under the microscope. Both UV mutant BSM54 and wild-type strains did not show the significant differences in groups treated with butanol fractions at the same concentration of 125 μg/ml, but the mutant BSM54 strain at the concentration of 250 μg/ml inhibited the spore germination over 2-fold stronger than that of the wild-type strain. Especially, the spore suppressive rate of the wild-type strain was 43.5% at the concentration of 500 μg/ml, whereas the spore germination in mutant strain did not completely occur at the same concentration. The mutant BSM54 strain showed a stronger suppressive activity on the spore germination of B. cinerea at the same concentration of over 250 μg/ml.
7. The possibility of change on the antifungal activity of UV mutant BSM54 strain during the storage period
To investigate whether the revertants, which are returned to original conditions through back mutation, appeared during the storage in the –70℃ freezer in glycerol stocks, the changes of antifungal activities of the mutant strain were measured. The diameter of growth inhibition zones on bioassay against F. oxysporum was compared with the wild-type strain at intervals of one month from 2 months up to 2 years, The antifungal activities of mutant BSM54 strain showed the narrow margins during the storage periods, but the activities of the strain from 2 months to 2 years did not show significant differences.
8. Comparison of the iturin production from wild-type B. subtilis and iturin high-yielding mutant BSM54 strains
The production capacities of iturin in butanol fractions evaporated in vacuo from the butanol extracts of wild-type and mutant BSM54 strains were analyzed by HPLC and compared with authentic iturin A used as control. The amounts of iturins in each butanol fraction obtained from wild-type and mutant BSM54 strains were calculated as 4.175% and 8,716% from the quantitative analyses of HPLC chromatograms, respectively. Thus, the production capacity of iturin produced from the mutant BSM54 strain was about 2-fold higher than that of wild-type strain.
9. Construction of transformation vector for site-directed mutagenesis
To clone the ORF1 region containing M1 point mutation site in the UV mutant BSM54 strain into the wild-type B. subtilis, the 1.8-kb PCR products were obtained by using the primer ORF1_u-f(5′-TAATCGCCGTCAGTTCCTCG-3′), ORF2-r (5′-TTCTCATCGACTCATACCGC- 3′), and Accu Power Pfu PCR Premix. Both PCR products and pUC19 vector were digested with EcoRI, ligated at 4℃ for 16 hrs, and the aliquots of suspension was added to the competent cell of E. coli DH5α used in transformation. The pBSM54-orf1 transformants obtained was double-digested with BamHI and XbaI. The isolated insert was ligated with spectinomycin resistance gene cassette digested with the same restriction enzymes as previously described from the pIC333 vector to constructed the pBSM54-orf1-sp vector for transformation. 10. Improvement of wild-type B. subtilis strain on the molecular level using the point mutated iturin biosynthesis gene through the site-directed mutagenesis To further increase the production capacity of iturin using iturin high-yielding mutant BSM54, site-directed mutagenesis was performed by using the gene of M1 point mutation region without the exchange of the amino acid among the six point mutation sites. The transformation vector pBSM54-orf1-sp-1 for site-directed mutagenesis was finally constructed using the ORF1 region containing M1 point mutation site obtained by PCR with proofreading DNA polymerase earlier, the QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, and mutagenic primers. To transform the wild-type B. subtilis strain by site-directed mutagenesis, the strain was cultivated until the absorbance of 0.1 at 580 nm was obtained in modified Spizizen medium. The aliquots of culture broth were then added to transformation vector pBSM54-orf1-sp-1. The suspension were spreaded on LB agar containing 60 μg/ml of spectinomycin and the colonies grown on the medium were primarily selected. The transformants were analyzed by PCRs with the orf1-f3, spcf1, spc-f2, hxlr1, and hxl-r2 primers and the resistant colonies that produced the PCR products of the same size as control were finally chosen. The single colonies of transformants selected were cultivated in the iturin production medium and the antifungal activities of the supernatants were examined on bioassays against F. oxysporum. The transformants T1 and T6 have exhibited larger growth inhibition zones than that of wild-type strain. To compare the contents of iturin produced from the wild-type strain and transformants T1 and T6, these strains were cultivated at 30℃ for 3 days and the butanol extracts of supernatants were quantitatively analyzed by HPLC. The iturin production of transformants T1 and T6 obtained by site-directed mutagenesis was increased 16% and 22% over the wild-type strain, respectively.
○ Mass cultivation and industrialization of cyclic lipopeptide high-yielding antagonistic microorganism Bacillus
Ⅳ. Results
1. We have developed several conditions for the optimal cultivation of B. subtilis subsp. krictiensis BSM54. The optimum concentrations of carbon source, nitrogen source and micro ingredient in cultivation broth were established, and the optimum cultivation and formulation process (freeze drying method) were designed. The antifungal activities of products did not show significant differences up to 2 years and the physical properties were good.
2. The iturin high-yielding mutant B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 showed high efficacies on gray mold, sclerotinia rot, bacterial rot, and Fusarium wilt diseases. Especially, the strain exhibited 60% efficacies on soilborne diseases.
3. To control the plant diseases such as bacterial wilt, Fusarium wilt, and gray mold, the optimal fermentation conditions, the development of application methods, and the elucidation of action mode for one microbial fungicide, which is prepared from B. subtilis subsp. krictiensis BSM54, were examined. We are under development new microbial fungicides using the strain in single or in combination with other antagonistic microorganisms.
4. For the domestic registration of environmentally-friendly agricultural & organic agricultural materials, the toxicities of the iturin high-yielding mutant B. subtilis subsp. krictiensis BSM54AS was examined. Through stipulated manner of test, toxicopathological characteristics of B. subtilis subsp. krictiensis BSM54AS were investigated. In all items of tests, the B. subtilis subsp. krictiensis BSM54 AS strain was proved as safety.
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