초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
<1세부과제 : GM작물 도입유전자 발현산물의 동물소화기내 지속성 분석>
○ 국내 애완동물 사료 시장 조사를 수행하여 시장 현황을 파악하였다.
○ LMO 표준품 총 68종을 확보하였고, 주요 LM작물 14종의 내재유전자 검출용 프로브, LMO 이벤트 특이 마커(옥수수 12종, 면실 8종 등)를 제작하여 실제 검출에 활용할 수 있음을 실증하였다.
○ 동물 사료에서의 GM벼 유래 도입유전자 검출 실험을 수행한 결과 조류, 토끼 및 설치류 사료 DNA에는 고분자의 genomic DNA와 단편으로 분

Ⅳ. 연구개발결과
<1세부과제 : GM작물 도입유전자 발현산물의 동물소화기내 지속성 분석>
○ 국내 애완동물 사료 시장 조사를 수행하여 시장 현황을 파악하였다.
○ LMO 표준품 총 68종을 확보하였고, 주요 LM작물 14종의 내재유전자 검출용 프로브, LMO 이벤트 특이 마커(옥수수 12종, 면실 8종 등)를 제작하여 실제 검출에 활용할 수 있음을 실증하였다.
○ 동물 사료에서의 GM벼 유래 도입유전자 검출 실험을 수행한 결과 조류, 토끼 및 설치류 사료 DNA에는 고분자의 genomic DNA와 단편으로 분해된 DNA가 공존함을 확인하였다. 한편, 사료 조성 및 DNA 상태가 변수로 작용하지만, 사료 DNA에서 GM작물 event-specific하게 정성 및 정량 분석이 가능함을 확인하였다.
○ 대부분의 조류, 토끼, 햄스터(설치류) 사료에서는 immunostrip을 이용한 PAT, Cry 및 EPSPS 단백질의 검출이 가능하였다. 그러나 거의 대부분의 개 사료에서는 검출되지 않았고 이는 사료 가공 시 고온 고압 처리에 의하여 대부분의 DNA가 분해되었기 때문으로 판단된다.
○ 사료 급이 후 대변에서의 GM작물 유래 도입유전자 산물 검출 실험을 수행한 결과 토끼와 설치류 대변에서는 도입유전자가 정성/정량 분석 가능한 수준으로 검출되었다.
○ 국내 개발된 가뭄저항성(MsrB2::bar 유전자 도입) 벼를 사료로 가공하여 시험동물 랫드의 사료 급이 실험을 수행한 결과 대변 내 도입유전자는 극미량 검출되었으며 향 후 정밀한 정량 검출 방법 필요하다고 판단된다. 한편, 대변 내 단백질은 거의 분해되어 항체 진단막대를 이용한 단백질 검출 시그널은 나타나지 않았다.
○ 해충저항성 Bt벼의 메추리 급이 실험 결과 양계용으로 사육된 조류(닭/메추리)의 대변에서는 도입유전자 검출이 가능함을 발견하였다. 이는 양계용 경우 불균질 파쇄된 곡물이 조류의 장내에서 불완전 소화될 경우 고형의 대변에 배출되기 때문으로 판단된다. GM작물을 급이한 소동물의 소화장기 내 도입유전자 산물 분석은 진행 중이다.
○ 종합적으로 동물 사료를 매개한 GM작물 유래 도입유전자 산물의 환경영향 고찰 결과는 다음과 같다.
- 동물사료는 종류에 따라 주의를 요함 : 조류(GM옥수수 알곡), 설치류(부분 파쇄된 GM 옥수수) 등.
- 동물 대변을 통한 GM작물 도입유전자의 비의도적 방출에 의한 환경영향은 거의 없을 것으로 판단됨.
- 양계용 닭의 경우 대변을 통한 GM작물(옥수수) 유전자 산물의 환경방출이 가능성이 높은 것으로 판단됨.
- 사료의 소화 후 대변에서는 분해된 단편(대부분 >200 bp 이하)이 방출되어 영향이 미미하다고 판단됨.
<2세부과제 : 조제사료의 GM작물 도입유전자 분석 및 모니터링 연구>
○ 가축사료 및 그의 원료곡물에 대하여 7가지의 비상업적 및 상업적인 추출방법을 비교한 결과 Wizard Genomic DNA Purification법, CTAB법 및 DNeasy Mericon Food법이 효율성과 균일성을 나타냈다.
○ 사료용 전지면실의 발아율 및 발아 불활성화 처리방법을 검토한 결과 열수 및 고압증기 처리가 면실 불활성화에 효과적인 것으로 확인되어 GM면실의 종자 발아력을 억제할 수 있는 방법으로 이용될 수 있다.
○ 농업용 GMO 검출을 위한 다중-PCR법 개발 및 사료내 GMO 검출기술을 도출하기 위하여 GM면실을 대상으로 면화 내재유전자를 포함 총 8종의 검출 마커쌍을 개발하고 다중
-PCR의 최대 검출한계를 확인한 결과 0.1% 농도범위까지 각 목적유전자를 검출할 수 있는 것으로 나타냈다.
○ 실시간-PCR 이용한 사료 내 GMO의 도입유전자들에 대한 프라이머 및 프로브를 개발하기 위하여 6작물(벼, 옥수수, 콩, 면화, 캐놀라, 밀)에 대하여 프라이머/프로브를 제작하였고, GM작물의 범용유전자로 35S, Nos, bar 및 EPSPS의 4종에 대하여 마커를 제작, 선발하였다. 총 10종의 PCR산물을 이용하여 정성 실시간-PCR의 표준물질의 표준플라스미드를 제작하였고, 이들 프라이머/프로브를 이용하여 각 목적유전자를 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
○ 가축에 대한 사료 GMO의 소화 분해성을 분석하기 위하여 전북 김제시 관내의 축산농가 4곳으로부터 8개 한우 대변 시료를 수집하였고, 시료를 냉동건조한 후 DNA를 추출하여 본 연구에서 수립된 다중-PCR방법으로 대변내 포함되어 있는 GM면화에 대한 검출을 수행하였다. 그 결과 소의 경우 대부분 먹이로 이용된 건초 및 TMR 원료가 완전히 분해되지 않은 상태로 배출되기 때문에 사료내 포함된 GM면화의 검출이 뚜렷하게 가능하였다.
○ 사료 GMO의 환경내 잔존성 확인을 위하여, 시판 토끼사료를 이용하여 토양잔존성을 확인하였다. 먼저 토끼사료를 분쇄하고 이를 실제 농가 밭토양 2곳에 50(H)×60cm(L) 넓이로 500mL씩 표토에 균일하게 혼합하여 처리한 1주일 후 정성 실시간-PCR을 수행하여 유전자 검출 유무를 확인한 결과 처리 토양 2곳 모든 유전자가 검출되지 않았다.
○ 본 연구에서 개발된 다중-PCR 및 실시간-PCR법은 사료용 GMO에 대한 안전 유통관리를 위한 환경모니터링 기술로 활용할 수 있을 것이며, 축사 주변 관리, 사료 잔유물의 관리, 농업용 GMO 처리 사업장의 주변, GM작물의 자생 여부 및 교잡에 의한 이력추적 등 농업환경의 GMO 안전관리에 활용할 수 있다.

Abstract ▼

Recently, various kinds of genetically modified (GM) crops have been imported and used as a raw material to manufacture foods and livestock feeds. In here we carried out several experiments to develop monitoring techniques to detect and to survey the trace amount of DNA or protein from the remains o

Recently, various kinds of genetically modified (GM) crops have been imported and used as a raw material to manufacture foods and livestock feeds. In here we carried out several experiments to develop monitoring techniques to detect and to survey the trace amount of DNA or protein from the remains of animal feeds which contains GM crops. For this, several different DNA-extraction methods were compared to the yields and quality of DNA extracted from feeds and feces from animals. The yield and purity of DNA extracted by the Wizard Genomic DNA Purification kit, CTAB method, and DNeasy Mericon Food method were better than that of other extraction methods.
From the both qualitative and quantitative PCR, common transgene sequences including CaMV 35S promoter and NOS 3’UTRs were easily detected from the feeds for bird, rabbit, or hamster. Also, it was possible to detects these gene fragments from the feces from rabbit, rat, hamster and chicken. This result says that the particle size of grains in feeds or undigested feces is the main source of detectable transgenes. Meanwhile from feeding experiment of rat, no noticeable transgenes were detected from the feces of rat which were fed with drought-tolerant GM rice as a feeds. Also from feeding experiment of quail which fed withthe insect-resistant GM rice, no transgene was detected. However, when the amount of template DNA was increase at the level of 600 ng per PCR reaction, traceable amount of PCR product was detected.
In cottonseed germination experiment, seed germination rate was between 50 and 95% according to the source of seed and the conditions of soils tested. Hot and wet steam or high-pressurized steam treatments were found to be more effective to inhibit seed germination than other treatments. To developed a multiplex PCR method for simultaneous detection of multiple target sequences in GM cottons, seven sets of primers were designed and confirmed to be a useful for verifying 7 different cotton events. Octaplex-PCR was proved as an useful detection method for the mixture of template DNA extracted from certified reference materials. The limit of detection (LOD) of our assay was approximately 0.1% (v/v) for GM cottons in event-specific octaplex-PCR. This method could be an effective tool for the identification and quality screening of a specific GM cotton event. Qualitative real-time PCR method was established to detect feeds containing GMOs. From this experiment, we were able to develop probes which can detect endogenous genes of six crop plants and 4 common transgenes such as P35S, TNos, bar, and EPSPS. All of the qualitative, quantitative, or multiplex PCR techniques we developed in this study, were considered to be an effective technique that are useful to detect and monitor the unintentional release of GM products to environment. Also, the results from this study can be used as a tool to develop a risk management poly for potential environmental hazard by the uncontrolled animal feeds.