초록 ▼

▣ NAD+/NADH ratio 조절 물질의 청력손상 보호 기전 규명
▶ 본 연구기간동안 선도물질 탐색을 통해 얻어진 β-Lapachone과 Dunnione을 이용하여 청력손상 보호 효과를 조사한 결과, β-Lapachone과 Dunnione은 노화 또는 시스플라틴에 의한 청력손상을 보호함을 확인하였음. 청력손상의 주요 인자들인 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성, DNA의 손상, 염증반응의 증가 등에 대한 이들 선도물질들의 영향을 확인해 본 결과, 노화 또는 시스플라틴에 의한 활성산소종의

▣ NAD+/NADH ratio 조절 물질의 청력손상 보호 기전 규명
▶ 본 연구기간동안 선도물질 탐색을 통해 얻어진 β-Lapachone과 Dunnione을 이용하여 청력손상 보호 효과를 조사한 결과, β-Lapachone과 Dunnione은 노화 또는 시스플라틴에 의한 청력손상을 보호함을 확인하였음. 청력손상의 주요 인자들인 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성, DNA의 손상, 염증반응의 증가 등에 대한 이들 선도물질들의 영향을 확인해 본 결과, 노화 또는 시스플라틴에 의한 활성산소종의 생성과 DNA 손상이 β-Lapachone과 Dunnione을 투여한 군에서는 현저히 감소되었음. PARP 단백질들은 DNA의 손상을 인지하여 손상된 부위에 결합함으로써 DNA 손상을 복구하는 중요한 조절인자로 현재까지 18가지 이상의 단백질들이 poly(ADPribose) polymerase 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며 이중 PARP-1이 대부분의 poly(ADPribosyl)ation (PAR)을 매개하는 것으로 생각되어지고 있음. 특히 PARP-1은 NAD⁺를 기질로 하여 poly (ADP-ribosyl)ation을 촉매하는데 이 과정에서 세포 내 NAD와 ATP를 고갈시키면서 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있음. β-Lapachone과 Dunnione의 PARP 활성화와 세포내 NAD⁺ 고갈에 대한 효과를 검증한 결과, β-Lapachone과 Dunnione을 투여한 마우스의 내이조직에서 시스플라틴에 의한 PAR의 발현 증가가 현저히 억제됨을 관찰되었으며 PARP 활성화 역시 현저히 억제됨을 확인하였음. 또한 β-Lapachone과 Dunnione은 PARP 활성화를 억제함으로써 시스플라틴에 의한 세포내 NAD⁺ 감소를 다시 회복시킴을 확인하였음. 세포내 NAD⁺ 고갈은 대사조절의 주요 인자로 알려진 SIRT1의 활성을 억제한다고 알려져 있기에 β-Lapachone과 Dunnione의 시스플라틴에 의한 SIRT1의 불활성화에 대한 효과를 확인한 결과, 시스플라틴 처리 시간에 의존적으로 내이조직의 SIRT1 발현이 감소된 반면 β-Lapachone과 Dunnione을 시스플라틴과 함께 투여한 마우스의 내이조직에서는 시스플라틴에 의한 SIRT1의 활성과 발현의 감소가 완벽히 회복되었음. 주요 종양 억제 microRNA (miR)인 miR-34a는 SIRT1 단백질의 발현을 억제함으로써 세포 사멸을 조절하는 것으로 보고되었기에 시스플라틴에 의한 SIRT1 발현 감소에 대한 β-Lapachone과 Dunnione의 회복 효과가 miR-34a의 발현 조절을 통하여 유도되는 지를 확인한 결과, 시스플라틴을 처리한 마우스의 내이조직과 청각세포에서는 miR-34a의 발현이 처리시간 의존적으로 증가된 반면 β-Lapachone과 Dunnione을 시스플라틴과 함께 투여한 군에서는 시스플라틴에 의한 miR-34a의 발현 증가가 현저히 억제됨을 관찰하였음. 또한 miR34-a가 직접적으로 SIRT1의 발현을 조절할 수 있는지를 검증해 본 결과 miR34-a를 과발현시킨 세포에서 SIRT1의 발현이 현저히 감소됨을 볼 때 내이세포에서도 miR34-a가 직접적으로 SIRT1의 발현을 억제함을 확인하였음. miR-34a는 암억제 단백질인 p53에 의해 유발되는 대표적인 암억제 miRNA로 알려져 있기에 p53의 활성화에 미치는 β-Lapachone과 Dunnione의 효과를 검증하고자 하였음. p53의 활성은 인산화와 아세틸화에 의해 활성화 된다고 알려져 있으며 특히 시스플라틴에 의한 세포독성에 p53의 아세틸화가 중요하다고 보고되어짐. 따라서 시스플라틴에 의해 청각세포에서도 p53의 아세틸화가 발생하는 지를 확인해 본 결과 시스플라틴 처리에 의해 아세틸화된 p53의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었으며 이는 다시 β-Lapachone과 Dunnione의 처리에 의해 p53의 탈아세틸화가 이루어짐을 마우스의 내이조직과 청각세포에서 확인하였음. 이상의 결과는 시스플라틴에 의한 SIRT1 발현의 감소는 p53-miR34a 경로를 통해 이루어 지며 β-Lapachone과 Dunnione는 세포내 NAD를 증가시켜 SIRT1의 활성을 증가시킴으로써 시스플라틴에 의한 p53-miR34a 경로의 활성화를 억제하여 SIRT1의 발현을 유지시켜 청력손상을 보호하는 것으로 사료됨.