초록 ▼

우리나라에서 분리된 어류 nodavirus들의 coat protein 염기서열을 분석하여 genotyping을 확인하였다. 우리나라에서 양식 중인 넙치(Paralichthys olivaceus), 능성어(Epinephelus septemfasciauts), 돌돔(Oplegnathus fasciatus), 숭어(Mugil cephalus), 터봇(Scophthalmus maximus) 등 11종의 어류 nodavirus들을 분리한 후 coat protein gene을 RT-PCR로 증폭 후 염기서열을 분석한 결과 서로 98% 이상이

우리나라에서 분리된 어류 nodavirus들의 coat protein 염기서열을 분석하여 genotyping을 확인하였다. 우리나라에서 양식 중인 넙치(Paralichthys olivaceus), 능성어(Epinephelus septemfasciauts), 돌돔(Oplegnathus fasciatus), 숭어(Mugil cephalus), 터봇(Scophthalmus maximus) 등 11종의 어류 nodavirus들을 분리한 후 coat protein gene을 RT-PCR로 증폭 후 염기서열을 분석한 결과 서로 98% 이상이 동질성을 나타내었으며, 다른 어류 nodavirus들과 계통분류 결과 우리나라의 어류 nodavirus 모두 RGNNV 유전자형에 속함이 확인되었다.

Nodavirus 게놈유전자가 암호화 하고 있는 단백질들의 면역유도특성은 coat protein, protein B1 및 B2 3종류의 단백질 모두 면역유도능력이 있으며, 바이러스에 대한 중화능력은 protein B1 및 B2에 대한 항혈청의 경우 바이러스에 대한 중화 역가가 낮았다. 반면에 coat protein에 대한 항혈청의 경우 중화 역가가 높게 나타났다.

그리고 어류 nodavirus 감염시 세포의 apoptosis의 유발 여부는 protein B1이 과다 발현된 세포에서 apoptosis가 유도됨이 확인 되었다. 이 결과로부터 어류 nodavirus 감염시protein B1에 의하여 숙주세포에 apoptosis가 유발됨을 확인 할 수 있었다.

유전자 정보를 이용한 백신 개발을 위해 재조합단백질 발현의 최적조건을 확인하였다.
백신 처리 후 면역관련 유전자 발현이 증가하며, 조직학적으로 안전성을 입증하였다.

(출처 : 보고서 요약 3p)

Abstract ▼

Ⅳ. Results
Fish nodaviruses of the genus Beta-nodavirus cause disease in more than 30 species of fish and have been reported in Asia, Europe, and Australia. Infection of these viruses cause nervous necrosis, encephalopathy, and retinopathy accompanied by abnormal swimming behavior, dark color, an

Ⅳ. Results
Fish nodaviruses of the genus Beta-nodavirus cause disease in more than 30 species of fish and have been reported in Asia, Europe, and Australia. Infection of these viruses cause nervous necrosis, encephalopathy, and retinopathy accompanied by abnormal swimming behavior, dark color, and massive mortality in hatchery-reared larvae and juveniles. Nerve tissue is the target tissue for viral nervous necrosis (VNN) infection, but fish nodavirus can also infect other tissue. The distribution of fish nodavirus in other tissues varies with fish species and age.

Fish nodaviruses were detected by RT-PCR from almost all the five fish species cultured in Korea. However, fish nodaviruses were detected at high ration in adult yellowtail and juvenile flounder. There was seasonal variation in the detection ratio of fish nodavirus. In February, March, and November when the water temperature is below 15℃, the detection ratio was very high.

However, in the other season when the water temperature is above 15℃, the detection ration was very low. We have isolated 11 fish nodaviruses from five fish species cultured in Korea; rock bream, Japanese flounder, sevenband grouper, turbot, and mullet. The partial gene of the coat protein from 11 fish nodaviruses were sequenced and the nucleotide sequences were phylogenetically analyzed. Phylogenetic analysis revealed that, even though their sequences were not identical, all the four Korean isolates were clustered into RGNNV genotype and this suggested that these 11 Korean isolates differentiated recently from a common ancestor.

The nucleotide sequence of the full size of RNA1 (3105 base) and RNA2 (1432 base) were determined and the phylogenetic analysis based on the full genomic RNA sequences revealed that the Korean isolates of fish nodaviruses were clustered into RGNNV genotype. Next, we determined the ORFs encoded by the nodavirus genome and found that RNA1 encoded RNA dependent RNA polymerase (982 aa), subgenomic RNA3 encoded protein B1 (110 aa) and B2 (75 aa), and finally RNA2 encoded coat protein (338 aa).

The immunogenecities of the recombinant proteins were determined by titration of anti-viral proteins using ELISA. The results showed that all the three viral proteins were immunogenic both in the mouse and flounder. Next, we determined the neutralizing titer of the anti-viral protein sera using neutralizing test. The results revealed that, of the three antisera against three viral proteins, only the anti-coat protein sera protected cells from fish nodavirua infection, which suggested that only the coat protein contained the neutralizing epitope. Korean isolates were determined and analysis of the genomic sequences revealed that the fish nodavirus encoded RNA polymerase, coat protein, protein B1 and B2. Of these viral proteins, coat protein, protein B1 and B2 were immunogenic but only the coat protein contained neutrlizing epitope.

(출처 : SUMMARY 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• 목차 ... 9
• Contents ... 10
• 그림목차 ... 11
• Figure lists ... 12
• 표목차 ... 13
• Table lists ... 13
• 제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 14
• 제 2 장 국내외 기술 개발 현황 ... 14
• 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 15
• 제 1절 양식어류의 노다바이러스 감염 현황 ... 15
• 1. 노다바이러스 감염 양식어류의 채집 ... 15
• 2. 어류 노다바이러스의 감염 현황 ... 16
• 제 2절 어류 노다바이러스의 유전자 및 계통분석 ... 18
• 1. 어류 노다바이러스의 게놈유전자 분석 ... 18
• 2. 어류 노다바이러스의 유전적 계통분석 및 기능성 유전자 특성 ... 23
• 제 3절 넙치에서의 어류 노다바이러스 재조합단백질에 의한 면역반응 및 백신 임상효능 ... 33
• 1. 어류 노다바이러스 재조합단백질에 의한 넙치의 면역반응 ... 33
• 2. 어류 노다바이러스 재조합단백질의 백신 임상효능 ... 35
• 3. 어류 노다바이러스 백신의 대량배양 및 최적발현조건 탐색 ... 37
• 4. 혼합백신의 임상효능 분석 ... 38
• 제 4장 요약 및 결론 ... 40
• 제 5장 연구 개발 결과의 활용 계획 ... 41
• 제 6장 참고문헌 ... 42
• 끝페이지 ... 43