초록 ▼

1. Adenovirus vector의 제작과 정제
☞ 연구에 필요한 LacZ발현하는 adenovirus는 BD회사의 Adeno-X-expression system과 Takara회사의 Adenovinls Expression Kit을 이용하여 제작하였으며, CsCl법과 Adeno-X virus purification kit (BD, CA)를 이용하여 대량 정제하였음. 또한 RCA는 식양청에서 ATCC (VR-1516)로부터 구입한 것을 분양 받았음.
2. RCA 측정을 위한 제한 효소 mapping법의 확립
☞ Xho

1. Adenovirus vector의 제작과 정제
☞ 연구에 필요한 LacZ발현하는 adenovirus는 BD회사의 Adeno-X-expression system과 Takara회사의 Adenovinls Expression Kit을 이용하여 제작하였으며, CsCl법과 Adeno-X virus purification kit (BD, CA)를 이용하여 대량 정제하였음. 또한 RCA는 식양청에서 ATCC (VR-1516)로부터 구입한 것을 분양 받았음.
2. RCA 측정을 위한 제한 효소 mapping법의 확립
☞ XhoI 제한효소로 RCA를 측정하는 방법을 확립하였으며, 또한 앞으로 제한효소에 의한 RCA 검출법의 flexibility를 증가시키기 위해 E1 영역에 있는 후보제한효소 (예: ClaI, SmaI, XbaI)가 있음을 NEBcutter program 상에서 확인하였음.
3. A549세포를 이용한 RCA assay
☞ A549세포를 한국세포주 은행으로부터 구입하여 CPE와 PCR의 결과를 비교 검토하였음. PCR에서는 RCA가 pfu 1, 6일 경과 후에는 sample 3개 모두가 관찰되었고, CPE assay에서는 RCA가 pfu 100에서 6일 경과한 후 sample 3개 모두에서 관찰되었음.
4. Real-time PCR set up
☞ Applied Biosystem의 real-time PCR을 확립하여 RCA의 particle이 $10^{8}$에서 $10^{1}$까지 linearity가 있음을 확인하였음. 사용한 probe는 TaqMan을 사용하였으며, reporter로서 FAM, Quencher로서 TAMRA를 사용하였음.
5. RCA가 포함된 adenoviral vector particle의 독성분석과 adenovirus vector의 감염에 의한 혈액에서의 유기대사물의 변화측정
☞ 아데노바이러스에 감염된 rat의 혈액에서 palmitoleic acid, oleic acid. linolenic acid가 대조군 보다 약 2배정도 높게 검출되어 앞으로 이러한 지방산은 adenovirus의 감염지표로 사용이 기대됨.

Abstract ▼

1. Construction and purification of adenovirus
☞ To construct for recombinant adenovirus expressing LacZ gene, we used with the Adeno-X-expression system (BD, CA) and Adenovirus Expression Kit (Takara). The viruses were propagated in 293 cells and virus st.ocks were prepared by a CsCI standard pr

1. Construction and purification of adenovirus
☞ To construct for recombinant adenovirus expressing LacZ gene, we used with the Adeno-X-expression system (BD, CA) and Adenovirus Expression Kit (Takara). The viruses were propagated in 293 cells and virus st.ocks were prepared by a CsCI standard procedure and Adeno-X virus purification kit (BD, CA). The seed RCA (adenovirus type 5) was purchased from A TCC (VR-1516).
2. Detection of RCA using restriction enzyme mapping
☞ The bands specifically derived from RCA were detected by the restriction enzyme, XhoI. There are another restriction enzyme, ClaI, SmaI, XbaI that are also used for the detection of the band derived from RCA.
3. RCA assay using A549 Cells
☞ A549 cells were obtained from the Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). We compared with RCA detection by PCR and CPE assay. In PCR, RCA was detected in all 3 samples infected with pfu 1 on day 6. However, in CPE assay, CPE was observed in all 3 samples infected with pfu 100 on day 6.
4. Real-time quantitative PCR set up.
☞ To set up a real-time PCR that can quantify the copy number of RCA, we made primers and probes for the detections of E1. The threshold cycle and log-transformed concentration showed in a linearity from $10^{8}$ to $10^{1}$. TaqMan probe was used In this experiment (Reporter; FAM, Quencher: TAMRA)
5. Detection of organic compounds in blood
☞ To examine how organic compounds change in rats following injection of adenovirus (LacZ gene expressing adenovirus, RCA), we analyzed blood in rats. Compared with control, palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid were increased about two times with infection of the viruses.

목차 Contents

• 연구결과보고서 ...1
• 표지 ...2
• 제출문 ...4
• 요약문 ...5
• Project Summary ...6
• 목차 ...7
• 제1장 서론 ...8
• 제2장 국내·외 기술개발 현황 ...9
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...10
• 1. 복제가능한 아데노바이러스 (RCA)의 제한효소, A549세포, PCR에 의한 분석 ...10
• 2. Adenoviral 벡터 주입에 따른 생체내 대사물질의 농도 변화 측정 ...17
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...30
• 1. 연구개발목표 달성도 ...30
• 2. 연구개발의 대외기여도 ...30
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...32
• 제6장 기타 중요변경사항 ...33
• 제7장 참고문헌 ...34
• 총괄 연구과제 요약 ...35
• 용역연구비 사용실적보고서 ...37