초록 ▼

■ 연구개발 목표 및 내용
전통 장류인 된장의 항산화, 항비만, 항염중효과를 in vitro 및 in vivo 모델에서 입증하고자 하며, 특히 첨단의 기능성 평가기술인 “Omics“ 기술을 활용하여 비만관련 염증을 억제하는 작용기전을 규명함으로서 한식세계화를 위한 경쟁력 있는 자료를 제공하고자 함.
○ 생리활성 물질에 대한 정보를 확보하기 위하여 찐대두와 발효된장의 숙성기간에 따른 성 분 (총폴리페놀, isoflavone)과 β-glucosidase 활성을 분석하고 항산화활성 (FRAP, DPPH와 ABTS 소거능)을 평

■ 연구개발 목표 및 내용
전통 장류인 된장의 항산화, 항비만, 항염중효과를 in vitro 및 in vivo 모델에서 입증하고자 하며, 특히 첨단의 기능성 평가기술인 “Omics“ 기술을 활용하여 비만관련 염증을 억제하는 작용기전을 규명함으로서 한식세계화를 위한 경쟁력 있는 자료를 제공하고자 함.
○ 생리활성 물질에 대한 정보를 확보하기 위하여 찐대두와 발효된장의 숙성기간에 따른 성 분 (총폴리페놀, isoflavone)과 β-glucosidase 활성을 분석하고 항산화활성 (FRAP, DPPH와 ABTS 소거능)을 평가함
○ LPS를 처리한 대식세포를 이용하여 된장의 숙성기간에 따른 항염증효과 (NO, PGE2, TNF-a, IL-6, MCP-1, COX-2, iNOS를 측정 비교함 ○ 식이유도 비만 (DIO) 동물모델에서 된장의 항산화·항염·항비만 기능성 (혈액의 항산화·항염증·지질대사지표 및 조직슬라이드분석 등)을 평가하고, 관련 질병으로의 확산을 억제하는지를 검중하기 위하여 간에서의 염중지표와 혈액의 인슐린저항성지표를 평가함
○ 국제적 첨단 생명과학 기법인 miRNA array를 활용하여 DIO 동물 모델의 adipocyte에서 유전자 발현을 분석하여 항산화·항염·항비만 기능성과 작용기전에 관한 분자수준의 역할을 밝히므로서 우수한 기능성에 대한 과학적 근거를 제공함.

■ 연구결과
1. 찐대두와 메주 및 숙성기간이 다른 된장의 생리활성 성분 함량 분석과 β-glucosidase 활 성 및 항산화효과 평가
○ 한식된장과 전통된장의 총 폴리페놀 함량은 숙성초기 3개월에서는 한식된장이 전통된장 보다 높았지만 6개월 이후에는 전통된장이 다소 높은 것으로 나타났음(p<0.001). 총 플라보노이드 함량은 숙성초기 3개월에서는 한식된장과 전통된장에서 비슷한 수준이었으나 6개월 이후에는 전통된장이 더 높은 것으로 나타났음(p<0.001). Isoflavone의 함량은 한식된장과 전통된장에서 비슷한 패턴을 보였으며, 숙성기간 3개월 후에는 대두의 glycoside isoflavone이 거의 대부분 aglycone으로 전환되었음.
○ 한식된장의 경우, β-glucosidase는 찐대두, 메주, 숙성기간에 따라 활성이 다르게 나타남. 메주발효기간에 상승하였다가 간장 뺀 후 담근 된장은 감소하였지만 숙성 8개월 이후 크게 증가하여 12개월 숙성 된장이 가장 높은 활성(3.80 U/g dry wt)을 보임(p<0.001). 전통 된장의 β-glucosidase 활성 0.20 U/g dry wt 으로 3~27개월의 숙성기간 동안 거의 변함이 없었음
○ DPPH 라디칼을 50% 제거하는 한식된장의 에탄올 추출시료의 농도(IC₅₀)는 찐대두에 비하여 메주에서 유의하게 감소하여 항산화효과가 상승하였음을 알 수 있었고(p<0.001), 숙성 초기에 증가하여 12개월까지 IC₅₀는 비슷한 수준을 유지하고 있었음. 전통된장의 DPPH 라디칼 소거효과 역시 숙성 3개월부터 27개월까지는 차이가 없었음. DPPH 라디칼 소거효과는 시료의 총 폴리페놀 함량과 유의한 음의 상관관계(r=-0.8725, p<0.001)를 보인 반면, 총 플라보노이드 함량과는 상관성이 없었음.
○ 한식된장의 에탄올 추출시료의 환원력(FRAP)은 찐대두=메주<한식0<한식1=한식3=한식6<한식8<한식 12(p<0.001) 이었고, 전통된장은 찐대두<전통27<전통3=전통6=전통 15(p<0.001) 으로 된장의 환원력은 메주발효과정에서 보다는 숙성 과정에서 증가하는 것으로 보임 .
○ 에탄올 추출시료의 ABTS+ 라디칼 소거능은 발효기간보다는 숙성기간에 증가하였음. 한식 된장은 숙성 6개월까지 빠르게 증가하였다가 이후 감소하는 패턴을 보였으나, 전통된장은 숙성 15개월에서 가장 높은 효과를 보였다가 이후 감소하였음.
○ 된장 에탄올 추출물로부터 순차적 용매추출 결과 디클로로메탄(DM) 분획과 에틸아세테이트(EA) 분획이 핵산, 부탄올, 물 분획에 비하여 월등하게 DPPH 라디칼 소거 효과와 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높았음. 된장시료 중 한식12의 DM, EA 분획이 총 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 항산화효과가 가장 높았음

2.. LPS 처리한 RAW 264.7 대식세포에서 한식된장의 항염중 효과 및 기전연구
○ 찐대두, 한식0, 한식6, 한식12의 DM, EA분획 실험 결과(100 μ g/mL) DM 분획은 경우 한식12만이 대조군의 55.6% 수준으로 NO 생성을 유의하게 감소시켰으며(p<0.001), EA분획은 한식6과 한식12가 NO 생성을 각각 대조군의 88.8%, 55.6% 수준으로 감소시켰음(p<0.001)
○ DM 분획과 EA 분획 모두 숙성기간이 길어질수록 PGE2 생성을 더 많이 감소시켰음.
○ DM 분획은 한식12만이 IL-6와 TNF-a 생성억제효과를 보였으며, 한식6과 한식12가 MCP-1 생성억제효과를 보였음. EA 분획은 한식0과 한식6도 IL-6와 MCP-1 생성억제효과가 약간 있었으나 한식12의 효과가 더 뚜렷하였고, TNF-a 생성억제효과는 모든 시료에 서 없었음. 한식12만이 DM, EA분획 모두 확실한 항염증효과를 나타내었음.
○ 한식12의 DM 분획은 LPS 처리에 의하여 촉진된 NF-kB의 활성화로 인하여 증가된 iNOS 와 COX-2 합성을 효과적으로 감소시켰으나, EA분획은 iNOS 합성만 감소시켰음.
○ 된장의 항염증효과는 DM과 EA분획 중에 있는 비극성의 폴리페놀이나 플라보노이드 계열의 물질로 추정되며 직접적인 작용과 함께 항산화효과를 통한 간접적인 작용으로 인한 결과로 생각됨. 추후 항염증효과를 나타내는 유효성분을 찾기 위한 심도 있는 연구가 필요함.

3. 식이유도 비만 (DIO) 동물모멜의 혈액과 간조직에서 된장의 항산화·항염·항비만 기능성 평가
○ 된장의 기능성 평가를 위하여 C57BL/6 마우스에 4가지 다른 식이(10% kcal 저지방식이, 45% 고지방식이, 45% 고지방식이 + 15% 된장, 45% 고지방식이 + 118% 찐대두)를 11주 동안 급이하였음.
○ 저지방식이와 비교하여, 고지방식이는 체중을 유의적으로 증가시켰고 된장은 체중의 증가를 억제하였으며 찐대두는 체중의 증가를 억제하지 못한 것으로 관찰됨.
○ 고지방식이로 인해 지방이 간조직과 지방조직에 축적되었고(p<0.05), 고지방식이와 비교할 때 된장급이 군에서는 지방축적이 유의적으로 감소하였음. 이에 따라 된장의 항비만 효과가 인정됨. 또한, 비만에 의하여 증가하는 혈중 Leptin 농도가 된장섭취에 의해 유의적으로 억제되었고 인슐린 저항성에 의해 증가한 혈당 및 인슐린의 농도도 감소되는 경향이 관찰되었음.
○ 간조직의 염증을 나타내는 혈액 생화학적 지표인 AST와 ALT 및 MCP-1 염증매개 인자는 고지방식이에 의해 유의적으로 증가하였는데 된장 섭취에 의해 염증지표들의 증가가 억제되었으나, TNF-a 와 CRP 농도에 대하여는 유의적인 영향을 나타내지 않았음.
○ 간조직에서 항산화 효소의 활성과 지질과산화 지표인 MDA 농도는 식이군 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았음. Total antioxidant potential을 나타내는 혈중 환원력 (FRAP)도 식이군 간에 유의적인 차이가 관찰되지 않았음.
○ 간조직의 조직병리 결과에 따르면, 모든 동물의 간조직에 지방이 축적되었는데, 고지방식에 의해 지방 droplet 이 커지고 많아졌는데 된장 섭취에 의하여 다소 감소하였으며, 중성지방 함량도 유사한 결과를 보였음. 즉 고지방식이에 의해 간조직의 지방축적이 유의적으로 증가한 것은 중성지방과 콜레스테롤의 축적에 의한 것으로 확인되었으며, 된장 급이 군에서는 중성 지방의 유의적인 차이는 관찰되었으나, 콜레스테롤에서의 차이는 관찰되지 않음.

4. 식이유도 비만동물의 비만세포에서 ‘Omics “ 테크닉을 활용한 miRNA microarray 분석 및 항산화·항염·항비만 작용기전의 분자수준 연구
○ 지방조직의 global miRNA profile을 microarray 분석을 통해 진행하였으며, 분석에 사용된 실험식이섭취군의 샘플 모두에서 발현된 272개의 miRNA가운데 33개 miRNA가 식이에 의하여 유의적인 발현 차이가 나타남. 저지방식이와 고지방식이 섭취군간 8개의 miRNA (고지방식이군에서 감소: miR-378a-5p, miR-378c, miR-193b-3p, miR-107-3p, miR-3069-3p; 고지방식이군에서 증가: miR-146b-5p, miR-16-5p, miR-155-5p)가 유의적인 차이 (기준: fold Change ≥ ±1.5)를 보였음. miR-378, miR-107, miR-146은 선행연구와 동일한 결과를 보여서 본 연구에 사용된 실험모델이 고지방식이에 의한 지방축적 및 지방세포의 분화를 유도하는데 적합함을 확인함.
○ 고지방+된장식이 섭취군은 고지방식이군과 비교시 1.5배 이상의 발현량 변화가 유의적 차이를 보인 miRNA는 없었으며, miR-664-3p, miR-378c, miR-30c-2-3p, miR-150-5p, miR-193a-3p는 고지방+대두식이 섭취군에서 고지방+된장식이 섭취군에 비하여 감소되었고, miR-211-3p는 고지방+대두식이 섭취군에서 증가됨.
○ 특히, 저지방식이와 고지방식이 섭취군간 (miR-193b-3p, miR-3069-3p, miR-16-5p, miR-155-5p), 고지방식이와 고지방+대두식이 섭취군간 (miR-362-5p)와 고지방+된장식이와 고지방+대두식이 섭취군간 (miR-664-3p, miR-150-5p, miR-211-3p) 차이를 보인 miRNA들은 아직 동물 지방조직에서의 역할이 규명되지 않은 새로운 miRNA들로 확인됨.
○ 지방식이 섭취군과 비교시 고지방식이 섭취군들은 지방조직무게가 유의적으로 증가하였지만, 고지방+된장식이 섭취군은 고지방식이와 고지방+대두식이 섭취군에 비해서 지방 조직무게의 증가가 유의적으로 낮았음. 지방세포 형태 (Adipocyte morphology)는 저지방식이 섭취군에 비해서 고지방식이 섭취군들은 유의적으로 단위면적당 지방세포수가 적고 지방세포 사이즈가 컸지만, 고지방식이 섭취군들간에는 차이가 없었음.
○ 항산화 및 항염증, 섬유화 지표 분석에서 산화스트레스 marker인 HO-1 mRNA 발현량과 항염증과 관련된 macrophage infiltration 및 phenotype switch 지표인 CD68, CD11c와 염증 adipokine 지표인 TNF α, MCP-1, 그리고 섬유화 지표인 TGF β mRNA 발현량은 저지방
식이 섭취군 및 고지방+된장식이 섭취군이 고지방식이 섭취군보다 유의적으로 감소하였음. 하지만, adipogenesis 관련 지표들은 실험식이섭취군간에 유의적인 차이를 보이지 않았음. 고지방 식이 섭취는 지방조직에서 산화스트레스, 염증반응, 섬유화를 촉진시키는 데, 된장을 섭취할 경우 이러한 증상이 억제 또는 완화되는 잠재적 효과가 있는 것으로 사료됨.

■ 연구성과 및 성과활용 계획
○ 연구원 양성 성과 : 4명
○ 논문 발표 계획 : 2015년 1건, 2016년 2건
○ 학회 발표 : 2015년 2건, 2016년 1건

( 출처: 연구개발보고서 초록 117p )

Abstract ▼

IV. Study results
1. Changes in some active components, β-glucosidase activity and antioxidant ability during fermentation and aging process from steamed soybean to doenjang
○ Total polyphenol content m meju (6.04 mg tannic acid/g dry wt) was significantly higher than that in steamed soybeans(

IV. Study results
1. Changes in some active components, β-glucosidase activity and antioxidant ability during fermentation and aging process from steamed soybean to doenjang
○ Total polyphenol content m meju (6.04 mg tannic acid/g dry wt) was significantly higher than that in steamed soybeans(3.07 mg/g dry wt), and it was increased gradually during aging. In Hansik doenj ang(fermented by inoculated Aspergillus Oryzae and Bacillus licheniformis), 3 month-aged doenjang(14.61 mg/g dry wt) contained highest total polyphenol contents, and it had been maintained until 12 months of aging. In Traditional doenjang (fermented by natural microorganism), 6 month-aged doenjang contained the highest total polyphenol contents(15.59 mg/g dry wt).
○ Total flavonoid content of meju(0.84 mg rutin/g dry wt) was significantly reduced compare to steamed soybeans (1.00 mg/g dry wt), but it was decreased at the beginning period of aging in Hansik doenjang and then recovered to the level as much as that in meju after 3 months of aging. In Traditional doenjang, it was gradually increased with aging until 15 months, and maintained thereafter. Total isoflavone content was the highest in steamed soybean(3.01 mg/g dry wt) in samples, however, it was significantly decreased during the fermentation and then decreased further very slowly during the aging in Hansik doenjang.
○ Glycoside isoflavone in steamed soybeans was converted to aglycone by the fermentation and aging process. Aglycone isoflavone content was more than 95% of total isoflavone content in doenjang after 3 month of aging in both of Hansik and traditional doenjang, and it had been maintained thereafter.
○ β-glucosidase activity was very low in steamed soybean(0.02 U/g dry wt), however, it was increased in meju (1.60 U/g dry wt), then slowly decreased until 6 months of aging and increased up to 0.83U/g dry wt at 8 months and 3.80 U/g dry wt at 12 months(Hansik doenjang), respectively. β-glucosidase activity in traditional doenjang was not changed during 3~27 months of aging.
○ DPPH radical scavenging effect were higher in meju than steamed soybeans. DPPH radical scavenging effect was increased gradually during the fermentation and the beginning 3 months of aging, and maintained thereafter. IC₅₀(ng/mL) for DPPH radical scavenging effect was significantly negative correlated with total polyphenol content in samples, but not with total flavonoid content.
○ Reducing power and ABTS radical scavenging effect were not changed by fermentation, but increased by aging. Reducing power was increased with longer aging in Hansik doengang, however, ABTS radical scavenging effect was highest in 6 month-aged doenjang.
○ Dichloromethan(DM) or ethylacetate(EA) soluble fraction in sequentially solvent extracted various fractions from doenjang ethanol extract showed the strongest antioxidant effect with higher polyphenol and flavonoid content than the others.

2. Antiinflammatory effects of doenjang in RAW 264.7 cells treated with LPS and its mechanism of the action
○ DM fraction from 12 month-aged Hansik doenjang(D12) reduced NO synthesis to 55.6% of control in LPS-treated RAW 264.7 macrophage cell, and EA fraction from 6 month-aged Hansik doenjang(D6) and D12 inhibited to 88.0% and 55.6% of control.
○ PGE2 synthesis inhibition effect of DM or EA fraction was higher with longer aging. In DM fraction, only D12 inhibited IL-6 and TNF- α synthesis effectively, and D6 and D12 inhibited MCP-1 synthesis. In EA fraction, D12 only obviously inhibited IL-6 and MCP-1 synthesis.
○ DM or EA fraction from D12 mildly reduced LPS-activated NF- _x B nuclear translocation, and DM fraction significantly reduced synthesis of iNOS and COX-2 protein, but EA fraction reduced only iNOS synthesis.
○ Further study is needed to find the effective component in DM and/or EA fraction showing antioxidant and/or antiinflammatory activity of doenjang.

3. Evaluation of activities of antioxidation, anti-inflammation and anti-obesity in blood and liver of DIO mice
○ For the in vivo animal studies, four different diets were synthesized and fed to 12 animals (C57BL/6, male) per each diet for 11 weeks; low-fat (10% kcal), high-fat (45% kcal), high-fat doenjang (15% wt/wt), high-fat steamed soy.
○ Compared with low-fat, high-fat diet increased significantly the body weights and those were significantly lower in doenjang diet than high-fat.
○ Due to high-fat diet, fats were accumulated in liver tissue and adipose tissue (p<0.05) and fats accumulation significantly decreased in doenjant diet. Leptin levels in blood were significantly lower in doenjang than in high-fat and insulin resistance was observed in high-fat and alleviated in doenjang.
○ AST and ALT as a biochemical parameter for liver inflammation and MCP-1 as a inflammaion mediator increased in blood of high-fat. Doenjang caused the significant decrease in AST, ALT and MCP-1. However, TNF-alpha and CRP were not significantly different in different diets.
○ The differences in antioxidant enzyme activities of liver tissue homogenates were not observed among the different diets. MDA levels in liver homogenates were not significantly different among groups. No changes in total antioxidant potential (FRAP) were observed m blood of animals.
○ From the liver tissue slides stained with H&E, the fat accumulation was observed in all animals. Fat accumulation was highest in the liver of high-fat group and lowered m doenjang. Similar results were confirmed in the TG contents measurement of liver. TG accumulation were highest in the liver of high-fat group and lowered in doenjang. Choesterol contests were not changed with high-fat and doenjang diets.

4. Analysis of miRNA microarray in adipocytes of diet induced mice using 'Omics' technology and study in mode of action at molecular levels against antioxidation, antiinflammation and antiobesity
○ Microarray analysis was used to compare global miRNA profiling among the dietary treatment groups in mouse epididymal adipose tissue. 272 miRNAs were identified through the data processing, and 33 miRNAs were significantly affected by the dietary treatment. 5 miRNAs (miR-378a-5p, miR-378c, miR-193b-3p, miR-107-3p, and miR-3069-3p) were significantly down-regulated in the high-fat diet group compared to the low-fat diet group (criteria： p-value<0.05 & fold change ≥ ±1.5)，whereas 3 miRNAs (miR-146b-5p, miR-16-5p, and miR-155-5p) were significantly up-regulated in the high-fat diet group. The previous studies showed that the expression of miR-378 and miR-107 was decreased according to the adipogenesis, whereas that of miR-146 was increased. These results suggest that the present study model is suitable for inducing the fat accumulation and the fat differentiation.
○ There was no difference in miRNA levels between the high-fat diet group and the high-fat Doenjang (DJ) diet group. On the contrary, 5 miRNAs (miR-664-3p, miR-378c, miR-30c-2-3p, miR-150-5p, and miR-193a-3p) were significantly down-regulated in the high-fat Steamed soy (SS) diet group compared to the high-fat DJ diet group, whereas 1 miRNA (miR-211-3p) was up-regulated.
○ In particular, we observed that levels of several novel miRNAs, which functions have not been identified in animal adipose tissues, were significantly different between the low-fat diet group and the high-fat diet group (miR-193b-3p, miR-3069-3p, miR-16-5p, and miR-155-5p), between the high-fat diet group and the high-fat SS diet group (miR-362-5p), and between the high-fat DJ diet group and the high-fat SS diet group (miR-664-3p, miR-150-5p, and miR-211-3p).
○ Epididymal adipose tissue weight in the high-fat DJ diet group was significantly lower than that in the high-fat diet group and the high-fat SS diet group. The number of adipocytes per unit area significantly was decreased in the high-fat diet group compared to the low-fat diet group, whereas adipocyte size was significantly increased in the high-fat diet group.
○ The mRNA expression of the oxidative stress marker (HO-1), macrophage markers (CD68 and CD 11c), pro-inflammatory adipokines (TNF a and MCP-1), and a fibrosis indicator (TGF /3) was significantly decreased in the low-fat diet group and the high-fat DJ diet group compared to the high-fat diet group. However, the expression of adipogenesis-related genes was not difference among the dietary treatment groups. These results suggest that the high-fat intake exacerbates the oxidative stress, inflammation, and fibrosis action in adipose tissue, but DJ may contribute to suppress or alleviate these responses.

( 출처: SUMMARY 10p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 15
• 목차 ... 16
• 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 17
• 제1절 연구개발의 필요성 및 배경 ... 17
• 1. 세계적인 비만 인구의 추세는 국가 문제로 대두됨 ... 17
• 2. 비만에 의한 또 다른 질병 유발의 원인은 만성염증임 ... 18
• 3. 첨단 생명과학 기술 ... 18
• 4. 한식 세계화를 위하여 전통 장류에 대한 심도 있는 기능성 연구를 통한 과학적인 자료의 축적과 홍보가 시급함 ... 19
• 제2절 연구개발의 목적 ... 20
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 21
• 제1절 전통 장류의 기능성 연구 ... 21
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
• 제1절 주관기관 연구내용 및 결과 ... 26
• 1. 연구수행 내용 및 방법 ... 26
• 2. 연구수행 결과 ... 30
• 제2절 제 1 협동과제 연구내용 및 결과 ... 39
• 1. 연구내용 및 범위 ... 39
• 2. 연구방법 ... 39
• 3. 연구결과 ... 45
• 제3절 제 2 협동과제 연구내용 및 결과 ... 69
• 1. 연구수행 방법 ... 69
• 2. 연구수행 결과 ... 71
• 제4절 결론 및 제언 ... 99
• 1. 한식된장과 전통된장의 발효숙성기간에 따른 활성성분 분석 및 in vitro 모델에서 항산화·항염증 효과 검증 ... 99
• 2. in vivo 동물모델에서 전통된장의 항산화·항염증·항비만 효과 검증 ... 100
• 3. 식이유도 비만동물의 비만세포에서 'Omics ... 101
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 103
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 104
• 1. 연구성과(건수로 표기) ... 104
• 2. 정책활용 ... 104
• 3. 언론홍보 및 대국민교육 ... 104
• 4. 기타 ... 104
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 105
• 1. 기능성식품 성분의 연구에서 Omics 기술을 사용한 국내외 사례분석 ... 105
• 제7장 참고문헌 ... 107
• 연구개발보고서 초록 ... 117
• 끝페이지 ... 121