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오믹스 기반 쌍자엽 식물의 방사선 반응 연구

Omics-based approaches to study radiation responses of a dicot plant

보고서 정보
주관연구기관 한국원자력연구원
Korea Atomic Energy Research Institute
연구책임자 이승식
참여연구자 정병엽 , 김진홍 , 배형우 , 박용대 , 정광우 , 이성범 , 정문수 , 류태호 , 이은희 , 고영삼 , 홍성현 , 최효진 , 최승희 , 조철오 , 조성기 , 박혜란 , 김재경 , 박하영 , 레미기우스 카왈라 , 숩브리트 카우어 , 프라프티 프라카쉬 , 파투마 주마피리
보고서유형3단계보고서
발행국가대한민국
언어 한국어
발행년월2018-01
과제시작연도 2017
주관부처 과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT
등록번호 TRKO201800042763
과제고유번호 1711064443
사업명 한국원자력연구원연구운영비지원
DB 구축일자 2018-12-01
키워드 방사선.애기장대.오믹스.샤페론.식물 스테롤.메이신유도체.방사성동위원소.Gamma-ray.Arabidopsis.Omics.Chaperone.Phytosterol.Maysin derivatives.Radioisotope.
DOI https://doi.org/10.23000/TRKO201800042763

초록

본 연구에서는 모델식물인 애기장대(쌍자엽 식물)를 이용하여 식물의 방사선에 대한 영향을 다각적인 면에서 분석 및 관찰하였다. 최신 분석기술 NGS기법을 이용하여 분자적 측면(예,transcriptome), 단백질 수준(예, proteome), 그리고 metabolome 수준에서 분석을 진행하였다. 분석결과들은 방사선반응지도 구축을 위한 데이터베이스에 저장될 예정이다. 방사선 기술을 이용한 신규유용유전자의 발굴하고자 식물의 항산화 효소인 ascorbate peroxidase(APX)를 클로닝하여 단백질의 활성을 방사선 조사 전/후에

Abstract

This project covers various molecular and physiological effects in Arabidopsis that is a model dicot for plant science in response to γ-irradiation. The effects are investigated through the multiple analyses of transcriptome, proteome, and metabolome using NGS technology, and the data will be deposi

목차 Contents

  • 표지 ... 1
  • 제 출 문 ... 3
  • 보고서 요약서 ... 5
  • 요 약 문 ... 7
  • SUMMARY ... 10
  • CONTENTS ... 13
  • 목차 ... 18
  • 표목차 ... 24
  • 그림목차 ... 25
  • 제1장 연구개발과제의 개요 ... 31
  • 제1절 연구개발의 필요성 ... 33
  • 제2절 연구개발의 목적 ... 35
  • 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 39
  • 제1절 국내현황 ... 41
  • 제2절 국외현황 ... 41
  • 제3절 세계 유사분야 기관과의 비교 ... 43
  • 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 45
  • 제1절 방사선 반응 쌍자엽 식물의 오믹스 연구 ... 47
  • 1. 쌍자엽식물(애기장대)의 영양생장기(초기 및 후기)의 방사선 반응 전사체(transcriptome) 분석 ... 47
  • 가. RNAseq 기법을 이용한 애기장대(영양생장기)의 감마선 선량별 전사체 분석 ... 47
  • (1) 애기장대 생장 및 감마선 조사 ... 47
  • 나. RNA sequencing 및 전사체 분석 ... 48
  • (1) 분석과정 ... 48
  • (2) RNA quality check 및 sequencing ... 49
  • (3) Sequencing data preprocessing ... 50
  • (4) Genome/Gene mapping ... 52
  • (5) DEG 분석 ... 53
  • (6) Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)을 이용한 Gene ontology (GO) 분석 ... 61
  • (7) 요약 ... 64
  • 다. 애기장대 전사체 분석 데이터 통합 발현분석 ... 65
  • (1) GSEA (KEGG Pathway) ... 65
  • 라. 애기장대(영양생장기)의 선량별 감마선 특이반응 휘발성 물질 프로파일링 ... 71
  • 마. 애기장대(영상생장기)의 감마선 특이 단백질 발현 양상연구 ... 74
  • (1) 애기장대를 이용한 감마선 반응 단백질체 확보 및 분석 ... 74
  • (2) 생장에 따른 애기장대의 감마선 반응 단백질체 분석 ... 75
  • (3) 선량별 애기장대의 감마선 반응 단백질체 분석 ... 77
  • 바. 애기장대(영상생장기)의 감마선 특이반응 이차대사물질 프로파일링 ... 79
  • (1) 애기장대의 이차대사물질 분리 및 GC-MS 분석 ... 79
  • (2) 감사선 선량별 이차대사물질 프로파일링을 위해 GC-MS 결과 분석 ... 80
  • (3) 감사선 선량별 이차대사물질 프로파일링 ... 82
  • 제2절 방사선 반응 유전자 및 단백질 연구 ... 85
  • 1. 방사선 반응 유전자 연구 ... 85
  • 가. GRG 프로모터 유전자의 클로닝 및 형질전환체 제작 ... 85
  • 나. 감마선 유도되는 AT4G22960 (GRG)의 분자 기능 규명 ... 85
  • (1) GRG 유전자의 조직 부위별 및 스트레스별 발현 분석 ... 86
  • (2) GRG 단백질의 세포 소기관 위치 확인을 위한 클로닝 ... 86
  • 다. 저준위 감마선의 선량 변화에 의한 AtAGO2pro1.3-kb::GUS 형질전환체의 GUS 발현 분석 ... 87
  • 라. 저준위 감마선 조사 후 AtAGO2pro1.3-kb::GUS 형질전환체의 기관 특이적인 GUS 발현 분석 ... 88
  • 마. 저준위 감마선 조사 후 AtAGO2 deletion promoter 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 89
  • 2. 방사선 반응 단백질 구조 및 기능 조절 연구 ... 90
  • 가. 감마선 및 다양한 스트레스에서 애기장대에 존재하는 APX 유전자의 발현 분석 ... 91
  • 나. APx 단백질 순수분리 ... 92
  • 3. AGO2 방사선 유도 기작 규명 ... 92
  • 가. 저준위 감마선 조사에 의한 AtAGO2 deletion 프로모터 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 92
  • (1) AtAGO2 deletion 프로모터 형질전환체들의 AGO2 및 GUS 유전자의 발현 분석 ... 92
  • 나. 선량별 감마선 조사에 의한 AtAGO2 프로모터 형질전환체의 GUS 발현 분석 ... 93
  • (1) AtAGO2 프로모터 형질전환체의 GUS 활성 분석 ... 93
  • (2) 선량별 감마선 조사에 의한 AtAGO2 프로모터 형질전환체의 AGO2 및 GUS 유전자의 발현 분석 ... 94
  • 다. AtAGO2 프로모터 형질전환체의 조직 특이적인 GUS 발현 분석 ... 95
  • (1) AtAGO2 프로모터 형질전환체의 GUS 발현 분석 ... 95
  • 라. Transcription factor가 결합 가능한 AtAGO2 프로모터의 특정 부위(cis-element) 추적 검증 ... 96
  • (1) Electrophoretic mobility shift assay(EMSA) 기법을 이용한 AtAGO2 프로모터의 특정 부위 분석 ... 96
  • 마. 다양한 genotoxic agent를 이용한 AtAGO2 프로모터의 반응 기작 규명 ... 98
  • (1) DNA double-strand break(DSB) 유도물질 처리에 의한 AtAGO2 deletion 프로모터 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 98
  • (2) DSB 유도물질 처리에 의한 AtAGO2 deletion 프로모터 형질전환체들의 GUS 활성 분석 ... 99
  • (3) DNA replication 저해물질 처리에 의한 AtAGO2 deletion 프로모터 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 100
  • 바. 저준위 감마선 조사와 genotoxic agent 처리 후 회복 단계에서의 AtAGO2 프로모터의 반응 기작 규명 ... 102
  • (1) 감마선 조사 후 회복 단계에서의 AtAGO2 프로모터 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 102
  • (2) DSB 유도물질 처리 후 회복 단계에서의 AtAGO2 프로모터 형질전환체들의 GUS 발현 분석 ... 103
  • 4. 방사성동위원소를 이용한 신규 식물스테롤 생합성 경로 규명 ... 105
  • 가. 안정동위원소(stable isotope)인 [13C] 표지된 기질을 이용하여 신규 생육기작 규명 및 식물스테롤 생합성 추적 검증 ... 105
  • (1) [13C]-ethanol을 이용한 식물스테롤의 GC-MS 분석 ... 105
  • 나. 방사성동위원소인 [14C] 표지된 기질을 이용하여 신규 생육기작 규명 및 방사성 식물스테롤과 유기산 생합성 추적 검증 ... 108
  • (1) [14C]-glucose를 이용한 식물스테롤의 thin layer chromatography(TLC) 분석 ... 108
  • (2) [14C]-ethanol를 이용한 유기산의 TLC 분석 ... 108
  • 5. 애기장대 APX 단백질 연구 ... 109
  • 가. AtAPX1 단백질의 정제 및 분리 ... 109
  • 나. AtAPX1 단백질의 구조분석 ... 110
  • 다. AtAPX1 단백질의 APX 활성과 샤페론 활성 분석 ... 111
  • 6. 애기장대 감마선 유도 유전자의 분자적 기능 규명 ... 111
  • 가. At4g22960 (GRG)의 발현조절 규명 ... 111
  • 나. GRG 프로모터 유전자의 클로닝 및 형질전환체 제작 ... 112
  • (1) GRG 프로모터 유전자의 클로닝 ... 112
  • (2) GRG 프로모터 분석을 위한 애기장대 형질전환체 제작 ... 113
  • (3) GRG 프로모터-GUS 돌연변이체를 이용한 GRG 발현 분석 ... 114
  • 7. RI 이용 생합성 경로 규명 (II) ... 116
  • 가. ACS 효소 활성 분석을 위한 E. coli에서의 ACS 단백질들의 과발현 및 순수 분리 ... 116
  • 나. OsACS1 및 OsACS2 단백질의 ACS 효소 활성 분석 ... 117
  • 다. 벼의 protoplast를 이용한 OsACS1 및 OsACS2의 세포내 위치 분석 ... 118
  • 라. OsACS1 및 OsACS2 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이체 선별 ... 119
  • 마. [14C]-ethanol을 이용한 acs 돌연변이체들의 식물스테롤 생합성 분석 ... 121
  • 바. [13C]-ethanol을 이용한 acs 돌연변이체들의 식물스테롤 생합성 분석 ... 123
  • 사. [13C]-ethanol을 이용한 WT에서의 지방산 생합성 분석 ... 124
  • 8. 방사선 반응 단백질 구조 및 기능 조절 연구 ... 125
  • 가. 감마선 유도 단백질의 기능 및 구조 조절 연구 ... 125
  • (1) AtAPX1 단백질의 구조 분석 ... 125
  • (2) AtAPX1 단백질의 기능 분석 ... 128
  • (3) 전사 후 변형에 의한 AtAPX1 단백질의 기능 및 구조 분석 ... 131
  • (4) 벼 (IR29)에서 OsAPX2 단백질의 구조 및 기능 분석 ... 132
  • 제3절 방사선 반응 오믹스 데이터 활용 연구 ... 141
  • 1. 방사선 반응 유용물질 연구 ... 141
  • 가. 메이신(유도체) 중 항당뇨 활성 단일 유효성분 확인 ... 141
  • (1) 근육 세포를 이용한 세포내 포도당 유입 활성 확인 (2-NBDG assay) ... 141
  • (2) 근육 세포를 이용한 인슐린 신호전달 분자 발현 확인 ... 142
  • (3) 인슐린 신호전달 분자들의 발현을 조절하는 전사인자 활성화 확인 ... 144
  • (4) 인슐린 신호전달 분자의 전사조절 인자 활성 확인 ... 146
  • (5) 전사인자의 활성 조절능력 확인 ... 147
  • 나. 방사선 이용 신규 유용물질 탐색(I) ... 148
  • (1) 그라비올라 추출 용매에 따른 생리 활성 비교 ... 148
  • 다. 감마선 조사에 의한 그라비올라 추출물의 생리 활성 ... 153
  • (1) 그라비올라 추출물 감마선 조사 ... 153
  • (2) 감마선 조사된 그라비올라 추출물 HPLC 분석 ... 154
  • (3) 감마선 조사된 그라비올라 추출물의 생리활성 분석 ... 156
  • 2. 오믹스 데이터 활용 연구 (I) ... 158
  • 가. 방사선 유도 유용 유전자 선별 및 검증(I) ... 158
  • 3. 메이신 유도체의 단일 물질 복합 처리 ... 159
  • 가. 잔디추출물에서 분리한 메이신 유도체 단일물질들의 복합 처리에 의한 Amyloid-beta의 oligomerization 형성능 연구 ... 159
  • 나. 잔디추출물 Orientin에 의한 APP의 cleavage 효소인 BACE1 억제 작용 연구 ... 160
  • (1) 잔디추출물 Rhamnasylorientin에 의한 APP의 cleavage 효소인 BACE1 억제 작용 연구 ... 160
  • (2) 잔디추출물 Maysin에 의한 APP의 cleavage 효소인 BACE1 억제 작용 연구 ... 161
  • 다. 방사선 이용 유용물질 탐색 (허브식물) ... 162
  • 4. 오믹스 데이터 활용 연구 (II) ... 169
  • 가. 방사선 유도 유용 유전자 선별 및 검증 ... 169
  • (1) Arabidopsis ascorbate peroxidase (AtAPx) 돌연변이체 선별 ... 169
  • (2) AtAPx 돌연변이체 선별 결과 ... 170
  • (3) AtAPx 돌연변이체 선별 결과 ... 171
  • 5. 방사선 분자변환을 이용한 신규물질 발굴(1종 이상) ... 173
  • 가. 감마선 조사를 이용한 신규 물질 생성 ... 173
  • 나. 다양한 암세포들을 이용한 감마선 조사 생성물의 세포 독성 확인 ... 179
  • 다. 감마선 조사 생성물에 의한 항암세포의 apoptosis 유도 및 cell cycle arrest 효과 확인 ... 181
  • 라. 감마선 조사 생성물에 의한 항암세포의 DNA 절편 ... 184
  • 마. 감마선 조사 생성물을 이용한 암세포 침윤능 확인 ... 186
  • 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 189
  • 제1절 연도별 목표 달성도 ... 191
  • 1. 2015~2017년 목표 달성도 ... 191
  • 제2절 주요 연구성과 ... 192
  • 1. 감마선 반응 AGO2 프로모터 분석 ... 192
  • 가. 감마선에 특이하게 유도되는 AGO2 유전자 발굴 ... 192
  • 나. 감마선에 반응하는 AGO2 프로모터 확인 ... 192
  • 다. 감마선 반응 AGO2 프로모터 분석 ... 193
  • 라. 관련분야의 기여도 ... 194
  • 2. 식물의 방사선 반응 전사체/단백질체 분석 ... 194
  • 가. RNAseq을 통한 애기장대 감마선량별 전사체 분석 ... 194
  • 나. 애기장대 영양생장초기 감마선량별 단백질체 분석 ... 195
  • 다. 관련분야의 기여도 ... 196
  • 3 감마선 반응 애기장대 AGO2 프로모터 활성 부위 규명 ... 196
  • 가. 감마선 특이 유도 유전자인 AGO2 형질전환체에서의 전사체 검증 ... 196
  • 나. 감마선 선량 의존적 유전자 발현 검증 ... 196
  • 다. DSB 유도 genotoxin 반응 양상 규명 ... 197
  • 라. 조직 특이적 AGO2 발현 검증 ... 197
  • 마. 관련분야의 기여도 ... 198
  • 4 방사성동위원소 표지를 이용한 식물 대사물질 생합성 신규 경로 규명 ... 198
  • 가. 글루코스로부터의 식물스테롤 합성 확인 ... 198
  • 나. 식물스테롤 생합성 경로에서 에탄올의 역할 검증 ... 199
  • 다. 지상부와 지하부에서 식물스테롤 생합성 시 에탄올 역할 검증 ... 199
  • 라. 관련분야의 기여도 ... 200
  • 5 방사선 유도 유전자(AtAPX1)의 단백질 구조 및 활성 검증 ... 200
  • 가. 방사선 유도 AtAPX1 단백질의 정제 및 분리 ... 200
  • 나. 방사선 유도 AtAPX1 단백질의 구조 분석 ... 201
  • 다. AtAPX1 단백질의 APx 활성과 샤페론 활성 분석 ... 201
  • 라. 관련분야의 기여도 ... 202
  • 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 203
  • 제1절 과학기술적 활용 ... 205
  • 1. 방사선반응지도 구축을 위한 기초자료 제공 및 생명공학 원천기술 확보 ... 205
  • 제2절 사회경제적 활용 ... 205
  • 제6장 참고문헌 ... 207
  • 서지정보양식 ... 213
  • BIBLIOGRAPHIC INFORMATION SHEET ... 214
  • 끝페이지 ... 215

표/그림 (171)

연구자의 다른 보고서 :

참고문헌 (25)

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