[보고서]당뇨합병증을 억제시킬 수 있는 Chrysin과 Eucalyptol의 분자영양학적인 기전연구: 당뇨병신증과 당뇨망막병증 발병기전 중심으로

강영희

보고서 정보

주관연구기관

한림대학교
HalLym University

연구책임자

강영희

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-05

과제시작연도

2017

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO201900022795

과제고유번호

1711051697

사업명

개인기초연구(미래부)

DB 구축일자

2020-07-29

키워드

당뇨합병증.생활습관병.사구체경화.당뇨병성 신증.크리신.세뇨관 상피조직 섬유증.당뇨병성 망막병증.유칼립톨.망막혈관신생.

표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse에 10mg/kg의 농도로 10주간 chrysin을 투여한 후 당화혈색소(HbA1c)와 10주간의 공복혈당을 측정한 결과 chrysin을 투여한 경우 당화혈색소의 수준과 공복혈당이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다
표 신장 세뇨관 세포을 고혈당에 노출시킨 후 당뇨병으로 인한 합병증의 하나인 신세뇨관 경화증을 유발하는 대표적인 기전인 epithelial cell mesenchymal transition(EMT)에 관여하는 인자인 N-cadherin과 E-cadherin의 발현을 day course 별로 확인하였으며, 단백질의 발현이 급격히 증가하는 72시간을 기준으로 신장 신세뇨관 상피세포인 proximal tubular cell에 33mM의 고혈당을 처리한 후 1-20uM의 농도의 chrysin을 처리한 후 mesenchymal marker인 N-cadherin 단백질의 발현 억제효과와 epithelial marker인 E-cadherin의 상승효과를 확인하였다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse의 신장 세뇨관 조직에서 발현되는 EMT 관련 단백질의 발현을 immunohistochemical staining통해 확인해 보았다. 10mg/kg의 농도로 10주간 chrysin을 투여한 후 세뇨관에서 발현되는 alpha-SMA 와 FSP-1 단백질의 발현을 측정하였다. 그 결과 제 2형 당뇨 모델인 db/db 세뇨관 부위에서 각각 단백질의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 여기에 chrysin을 투여한 경우 단백질의 발현이 정상 수준으로 감소하는 것을 확인하였다
표 33mM 포도당 배지에서 신장 세뇨관 상피세포인 proximal tubular cell을 3일간 배양하여 신장세포를 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 세뇨관 경화증과 밀접한 관련이 있는 섬유화 단백질의 분비 및 발현을 확인하였다. chrysin은 세뇨관 세포에서 고혈당의 자극에 의해 분비가 촉진되는 신장조직의 extracellular matrix protein인 collagen type IV의 분비와 connective tissue growth factor(CTGF)의 분비와 생성을 억제한다는 사실을 보여주었다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse의 신장조직을 이용하여 masson-trichrome staining을 통해 세뇨관에 축적된 collagen fiber를 염색한 결과 control mouse와 비교하여 db/db mouse의 세뇨관 사이에 collagen fiber(blue color)가 축적되있는 것을 확인하였고, 10mg/kg의 농도로 10주간 chrysin을 투여한 mouse의 조직에서는 collagen fiber의 염색이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였다
표 33mM 포도당 배지에서 신장 사구체 상피세포인 podocytes(족세포)을 3일간 배양하여 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 제 2형 당뇨에서 사구체 족세포의 손실은 고혈당에 의한 세포사멸이라고 생각하였다. TUNEL 실험을 실시하였더니 고혈당에 의해 족세포는 DNA fragmentation이 초래되어 세포사멸을 일으키는데, 여기에 chrysin을 처리한 경우에 DNA fragmentation은 농도의존적으로 감소시켜 세포사멸을 억제시킨다는 것을 알 수 있다
표 제 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스를 이용하여 10주간 10mg/kg의 농도로 chrysin을 투여한 후 사구체 신장조직에서 소포체 스트레스 (ER stress)를 확인하고자 하였다. 우선 chrysin 투여는 신장조직에서의 ER stress를 완화시키는 것으로 나타났다. db/db 마우스의 신장 조직을 추출하여 절제하여 ER stress를 조사하였다. ER stress가 초래되면 UPR이 활성화 되는데 ER의 transmembrane 단백질인 PERK가 활성화되고 동시에 GRP78가 발현되는데 이러한 현상이 당뇨쥐의 신장조직에서 뚜렷하였다. 여기에 chrysin을 투여한 경우에 PERK의 활성은 차단되었기 때문에, 이로서 chrysin은 당뇨에 의한 ER stress를 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 chrysin은 ER stress chaperone인 ATF4의 발현도 억제시키면서 CHOP의 발현도 동시에 억제시키키 때문에 ER stress에 의한 세포사멸을 억제시킨다는 것을 알 수 있다
표 제 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스를 이용하여 10주간 10mg/kg의 농도로 chrysin을 투여 한 후 당뇨 합병증으로 일어나는 사구체 족세포의 조직학적 변화를 전자현미경을 통하여 관찰하였다. 우선 db/db 마우스는 albuminuria를 보여주지만 chrysin을 투여한 경우에 proteinuria의 현상을 정상적인 수준까지 호전되었다. 전자현미경으로 관찰한 족세포의 slit diaphragm의 형태는 손상되고 족세포와 족세포의 연결이 이루어지지 않은 것 으로 보이며, chrysin 투여는 이러한 비정상적인 족세포 구조를 원상복구시킨다는 것을 확인하였다
표 33mM 포도당 배지에서 신장 세뇨관 상피세포인 podocytes을 3일간 배양하여 족세포를 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 여기에 족세포 slit 단백질인 nephrin과 podocin의 발현을 조사하였다. 농도의존적으로 chrysin은 고혈당에 의하여 감소된 족세포 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 파악하였다. 이것은 족세포의 세포사멸이 완화되었기 때문으로 본다. 뿐만 아니라 제 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스를 이용하여 10주간 10mg/kg의 농도로 chrysin을 투여한 후 당뇨로 인한 족세포에 존재하는 단백질인 podocin의 손실을 확인하고자 하였다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse의 신장조직을 이용하여 PAS staining과 masson's trichrome staining을 통해 세뇨관의 mesangial cell에서 glycogen, collagen fiber를 염색한 결과 control mouse와 비교하여 db/db mouse의 사구체 mesangium 사이에 glycogen(purple color), collagen fiber(blue color)가 축적되는 것을 확인하였고, 10mg/kg의 농도로 8주간 chrysin을 투여한 mouse의 조직에서는 glycogen, collagen fiber의 축적이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였다
표 100μg/ml AGE-BSA에 노출하여 사구체 mesangial cell을 3일간 배양하여 신장세포를 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 자극에 노출된 activated mesangial cell은 myofibroblast로 전환되면서 α-SMA를 새로이 형성하고 fibroblast 특정 지표인 FSP-1의 발현과 섬유화 단백질을 생성하면서 사구체 경화증이 유발되는데, western blot을 통하여 확인해본 결과 각각의 단백질은 100μg/ml AGE-BSA 자극에 노출 시켰을 때 α-SMA와 FSP-1의 발현이 급격히 증가하였고 chrysin을 1-20uM 농도로 세포에 처리하였을 때 발현이 모두 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 또한 chrysin은 collagen Ⅰ및 collagen Ⅳ의 분비와 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 세포외기질을 생성을 유도하는 connective tissue growth factor(CTGF)의 발현 또한 억제하는 것을 확인하였다
표 100μg/ml AGE-BSA를 처리하여 mesangial cell을 3일간 배양한 후 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 최종당화산물에 노출된 mesangial cell은 경화에 관여하는 대표적인 사이토카인인 TGF-β을 분비하게 되고 TGF-β receptor-smad 로 신호전달이 이루어 지면서 사구체 경화가 일어나게 된다. 확인해본 결과 TGF-β receptor Ⅰ과 TGF-β receptor Ⅱ의 단백질 발현은 최종당화산물의 자극에 노출 시켰을 때 발현이 급격히 증가하였고 chrysin을 1-20uM 농도로 세포에 처리하였을 때 발현이 모두 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 최종당화산물의 자극에 노출 시켰을 때 TGF-β의 분비가 급격히 증가하였고, chrysin을 처리하였을 때 분비가 감소하는 것을 확인하였다
표 Chrysin이 TGF-β/SMAD 경로를 통하여 사구체 경화를 억제하는지 확인하기 위하여 10 uM TGF-β1 receptor inhibitor를 처리하여 western blot을 통하여 α-SMA와 FSP-1의 발현을 확인해보았다. 고혈당 배지와 100μg/ml AGE-BSA 배지에 노출된 activated mesangial cell은 α-SMA, FSP-1의 발현이 급격히 증가하였지만 10 uM TGF-β1 receptor inhibitor와 20uM chrysin을 처리하였을 때 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 최종당화산물로 인하여 TGF-β/SMAD signaling이 활성화되어 사구체 경화증 유발이 된 당뇨병성신증을 chrysin이 억제하는 것을 확인하였다
표 망막 미세혈관 내피세포를 고혈당 조건인 33mM 포도당 배지에서 5일간 배양하여 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 혈관신생에 관여하는 단백질인 HIF-1α와 VEGF의 발현을 day course별로 확인해본 결과 배양 2일째 단백질의 발현이 급격히 증가하는 것으로 나타나 단백질 발현이 최대가 되는 2일째를 기점으로 실험을 실시하였다. 망막 미세혈관 내피세포를 고혈당 조건인 33mM 포도당 배지와 1-20uM의 농도의 chrysin을 처리하여 2일간 배양한 후 당뇨합병증 상태에 놓이게 하였다. 그 후, 혈관 신생에 관여하는 대표적 단백질인 HIF-1α와 VEGF 그리고 VEGF receptor의 발현을 확인해본 결과, chrysin을 처리한 경우에 농도의존적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다
표 선행된 cell viability실험에서 망막 미세혈관 내피세포를 고혈당 조건인 33mM 포도당 배지에서 2일간 배양하였을 때 내피세포의 생존률이 유의적으로 감소하는 것을 확인하여 고혈당에 노출된 망막내피세포의 세포사멸과 chrysin의 억제효과를 알아보기 위해 Hoechst 33258 staining과 TUNEL assay를 실시한 결과 고혈당에 노출된 세포에서 세포사멸의 증가를 확인하였고, 여기에 1-20uM의 농도의 chrysin을 처리하였을 때 세포 사멸이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다
표 제 2형 당뇨모델의 망막에서 신생혈관 형성과 혈관 출혈을 확인하기 FITC-dextran 염료를 perfusion을 통해 주입한 후 눈에서 망막을 분리하여 flat mount를 실시하였다. 그 결과 제 2형 당뇨모델쥐에서 비정상적인 혈관 형성으로 인한 혈관 덩어리(red arrow)를 발견할 수 있었으며, 비정상적인 혈관 생성으로 인한 혈관 사이 누출(출혈: yellow arrow)이 나타난 것을 확인할 수 있었다. 반면에 10 mg/kg chrysin을 처리한 동물모델에서는 혈관덩어리나, 혈관의 누출이 발견되지 않아 chrysin이 신생혈관 형성으로 인한 당뇨병성 망막병증을 완화시키는 것을 확인할 수 있었다
표 Acellular capillary는 당뇨병성 망막병증에서 혈관주위세포와 내피세포가 손실되어 나타나는 병리학적 증상으로 이를 확인하기 위해 지 2형 당뇨병 동물모델에서 망막을 분리해내어 trypsinization을 통해 망막 모세혈관을 분리한 후 H&E staining을 통해 확인하였다. 그 결과 제 2형 당뇨모델에서는 acellular capillary(black arrow)이 나타나는 것을 확인하였고, 반면에 10 mg/kg chrysin을 처리한 동물모델에서는 acellular capillary가 control과 유사한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다
표 제 2형 당뇨모델의 눈을 적출하여 신생혈관 형성과 관련된 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과 제 2형 당뇨모델에서는 신생혈관 형성에 관여하는 단백질인 HIF-1α와 VEGF의 발현이 control 그룹에 비해 급격하게 증가하는 것을 확인하였고 여기에 10 mg/kg chrysin을 처리한 동물모델에서는 발현이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 면역염색을 통해 VEGF receptor의 발현을 확인한 결과 제 2형 당뇨모델에서 VEGF receptor의 발현이 급격히 증가하였으며 10 mg/kg chrysin을 처리한 동물그룹에서는 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였다
표 신장 근위세뇨관 세포를 고혈당에 노출시킨 후 당뇨병으로 인한 합병증의 하나인 신세뇨관 경화증을 유발하는 대표적인 기전인 epithelial cell mesenchymal transition(EMT)에 관여하는 단백질의 발현을 측정하였다. 고혈당에 의해 세뇨관 상피세포는 중간엽세포로 변화하는 과정을 겪으며 세포골격 단백질의 변화를 초래한다. 상피세포(epithelial cell)는 세포를 묶어주는 junction 단백질의 생성을 통해 조직의 구조를 유지하는 역할을 하지만 고혈당에 의해 유발되는 EMT로 인해 상피세포는 이동성이 강한 중간엽세포(mesenchymal)로 전환되어 세뇨관의 기질로 이동하게 되며, 신세뇨관 경화증을 일으키게 된다. 여기에 관여하는 대표적 인자인 N-cadherin, alpha-actin 단백질의 발현을확인하였다. 이 단백질들은 고혈당의 조건에서 발현이 증가하였으며, 1-20uM 농도의 eucalyptol을 처리한 결과 발현이 점점 감소하였다. 반대로 상피세포의 대표적인 마커인 E-caherin은 eucalyptol의 처리를 통해 점차 증가하는 효과를 확인하였다
표 고혈당의 자극으로 당뇨 합병증의 상태에 놓이게 한 신장 세뇨관 세포에서 세뇨관 경화증에 직접적으로 영향을 미치는 단백질의 발현을 확인하였다. 세뇨관 경화증과 밀접한 관련이 있는 세포외기질의 생성을 유도하는 CTGF와 collagen type Ⅳ 단백질의 발현을 확인한 결과 eucalyptol은 세뇨관세포에서 고혈당의 자극에 의해 분비가 촉진되는 CTGF와 collagen type Ⅳ 단백질의 생성과 분비를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 고혈당에 의해 유도되는 세뇨관의 경화증과 extracellular matrix의 증식은 matrix를 분해하는 효소인 matrix metalloproteinase(MMP)의 활성이 감소하였기 때문으로 생각되어 세뇨관 상피세포에서 MT-1 MMP의 발현을 확인한 결과 고혈당에 노출된 상피세포에서는 MT-1MMP의 발현이 감소하는 것을 확인 하였으며, eucalyptol을 처리하면 MT-1 MMP의 활성이 control 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. 이와 반대로 세포에서 MMP의 활성을 억제시키는 인자인 TIMP-2의 활성을 조사한 결과 MT-1 MMP의 활성과 반대로 고혈당은 TIMP-2의 발현을 증가시키는 것으로 나타났으며, 여기에 eucalyptol을 처리한 경우에 TIMP-2의 발현을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다
표 제2형 당뇨모델을 이용한 eucalyptol의 혈당조절 효과 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse에 10mg/kg의 농도로 8주 동안 eucalyptol을 투여한 8주간의 공복혈당과 와 당화혈색소(HbA1c)를 측정한 결과 eucalyptol을 투여한 경우 공복혈당과 당화혈색소의 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다
표 제2형 당뇨 동물모델에서 소변 양과 소변 알부민 측정 당뇨병의 대표적인 증상인 다뇨를 확인하기 위하여 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse를 이용하여 24시간동안 소변을 수집한 후 양을 측정하였으며 이것으로 소변 중 알부민 양을 측정하였다. 그 결과 8주간 10 mg/kg eucalyptol을 투여한 그룹에서 제 2형 당뇨그룹에 비해 소변의 양의 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, 또한 소변중의 알부민 수준 또한 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse의 신장조직을 이용하여 masson-trichrome staining을 통해 세뇨관에 축적된 collagen fiber를 염색한 결과 control mouse와 비교하여 db/db mouse의 세뇨관 사이에 collagen fiber(blue color)가 축적되있는 것을 확인하였고, 10mg/kg의 농도로 8주간 eucalyptol을 투여한 mouse의 조직에서는 collagen fiber의 축적이 control 수준으로 감소하는 것을 확인하였다
표 제 2형 당뇨 동물모델의 신장조직을 이용한 EMT 마커 발현 확인 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db mouse의 신장 조직을 이용하여 신장 근위세뇨관에서 발현되는 EMT 마커인 E-cadherin과 N-cadherin의 발현을 확인하였다. 그 결과 제 2형 당뇨모델인 db/db 그룹에서 E-cadherin의 발현이 감소하고, N-cadherin의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 여기에 8주 동안 eucalyptol을 투여한 경우 단백질의 발현이 정상수준으로 회복되는 것을 확인하였다
표 신장 족세포에 당뇨합병증의 대표적인 현상인 AGE를 5.5 mM 포도당 배지에 100 ug/ml 농도로 4일간 배양하였다. 또한 1-20 uM의 eucalyptol을 처리하여 당뇨병으로 인해 나타나는 신장 여과기능에 관여하는 foot processes 및 slit diaphragm 관련 단백질인 nephrin과 podocin의 발현을 확인하였다. 그 결과 100 ug/ml 배지에서 nephrin, podocin의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 인하였으나 eucalytol을 처리하였을 때 개선되는 효능이 나타나는 것을 확인하였다
표 AGE에 4일간 노출된 신장 족세포에서 slit junction 단백질인 FAT1, CD2AP 단백질들의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 100 ug/ml 배지에서 이 단백질들의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 인하였으나 eucalytol을 처리하였을 때 개선되는 효능이 나타나는 것을 확인하였다
표 제 2형 당뇨병 동물모델인 db/db 마우스에 10 mg/kg의 eucalyptol을 8주 동안 경구투여한 후 사구체에서의 족세포와 foot process의 손실 억제효과를 투과전자현미경으로 관찰하였다. 대조군 그룹과 비교하여 db/db 마우스 사구체 조직에서 족세포의 수가 감소하는 것을 확인하였으며, eucalyptol을 처리한 그룹에서는 족세포의 수가 control수준으로 유지 되는 것을 확인하였다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db 마우스의 신장 조직을 이용하여 신장 사구체 족세포에서 발현되는 slit diaphragm 마커인 nephrin, podocin, P-cadherin, integrin β1의 발현을 확인하였다. 그 결과 제 2형 당뇨모델인 db/db 그룹에는 이 단백질들의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며 여기에 8주 동안 eucalyptol을 투여한 경우 단백질의 발현이 정상수준으로 회복되는 것을 확인하였다
표 Immunohistochemical staining (IHC)를 통해 신장 족세포 junction에 영향을 주는 단백질중 하나인 Neprhin의 발현을 제 2형 당뇨동물 모델인 db/db 마우스의 신장조직을 이용하여 확인하였다. 그 결과 db/db 마우스의 사구체 조직에서 Nephrin(갈색)단백질의 저발현을 확인할 수 있었다. 반면에 10 mg/kg eucalyptol을 처리한 동물에서는 Nephrin 단백질의 발현이 정상수준으로 증가된 것을 확인 할 수 있었다
표 제 2형 당뇨 동물모델인 db/db 마우스의 신장조직에서 최종당화산물인 AGE와 AGE의 수용체인 RAGE 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과 db/db 마우스에서 AGE, RAGE 단백질이 과발현되었으며, 10 mg/kg의 Eucalyptol을 먹인 그룹에서는 두 단백질의 발현이 감소하였다

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