[보고서]파아지-항생제 시너지효과(Phage-Antibiotic Synergy, PAS)에 대한 멀티 페어 검증 및 기전 연구

명희준

파아지-항생제 시너지효과(Phage-Antibiotic Synergy, PAS)에 대한 멀티 페어 검증 및 기전 연구
Observation of Phage-Antibiotic Synergy (PAS) in multiple pairs of bacteria, phages and antibiotics and elucidation of its mechanism 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	한국외국어대학교 Hankuk University of Foreign Studies
연구책임자	명희준
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-05
과제시작연도	2017
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO201900022864
과제고유번호	1711051814
사업명	개인기초연구(미래부)
DB 구축일자	2020-07-29
키워드	파아지-항생제 시너지.광범위 멀티페어 조사.SOS 반응.세균 필라멘테이션.오믹스 방법.모델 동물.새로운 치료법.

초록 ▼

ㅇ 연구개요
아치사량(sublethal concentration)의 항생제 존재 하에서 숙주 박테리아가 자랄 때, 박테리오파아지가 감염하면 파아지의 증식이 늘어나는 현상을 파아지-항생제 시너지 효과(Phage-Antibiotic Synergy) 즉 PAS라 한다. 현재까지 10편의 그러한 논문만이 발표되었다. 본 연구에서는 숙주박테리아-파아지-항생제의 광범위한 멀티페어에서 PAS 현상을 확인하고, 그 기저의 메커니즘들을 밝히며, 그에 따른 새로운 파아지 면역(phage immunity) 효과를 발굴하고, PAS 현상을 이용하여 모델 동물에서 세균 치료방법 개선을 확인한다.

ㅇ 연구 목표대비 연구결과
파지가 아치사량의 항생제 존재 하에서 배양 된 박테리아에 감염되면, 파지 플라크의 크기가 현저하게 증가한다. 이 현상은 파지 - 항생제 시너지 (PAS)로 알려져 있다. 이 연구에서, PAS의 관찰은 다양한 항생제를 사용하는 다양한 박테리아 - 파지 pair로 확장되었다. PAS는 그람 양성균과 그람 음성균 모두에서 나타났다. 베타 - 락탐 항생제가 투여된 세포는 광범위하게 필라멘트화 되거나 팽창되어 파지 생성을 증가시킨다. PAS는 박테리아 필라멘트 생성의 유무에 따라 다양한 부류의 항생제에서 관찰되는 경우도 있었다. 항생제의 첨가는 다양한 박테리아에서 recA 발현을 유도 하였지만, 대장균의 recA 결실 돌연변이 균주도 역시 퀴놀론 항생제 존재 하에서 필라멘트화 및 PAS를 나타내었다. 파지 흡착 효율은 세포 표면이 필라멘트화됨에 따라 항생제 존재 하에서 변화하지 않았다. 이러한 세포에서 파지 단백질의 발현증가가 관찰되었지만, 이는 실제 생산 된 파지 수에는 거의 영향을 미치지 않았다. 대신, lysis 지연으로 인한 장기간의 조립 기간이 PAS의 주된 이유러 확인되었다. 세포 표면적의 증가는 필라멘트화한 숙주 세포에서의 파지 holin 생산의 증가를 훨씬 초과하므로, 숙주 막에서 홀을 응집시키고 형성하기위한 세포내 holin의 증가는 상대적으로 부족한 것이었다. 반응성 산소종 (ROS) 스트레스 역시 파지의 생성을 증가 시켰고 열 스트레스는 파지 생산의 제한된 증가를 보여 주었다.

ㅇ 연구개발결과의 중요성
PAS 현상은 그간 수십건이 보고되었으나, 그 기저에 깔린 메커니즘에 관해서는 시원한 규명을 하지 못했다. 본 연구에서는 PAS 현상의 기전을 명확히 밝힌 데에 그 의의가 있다. 나아가, 이 현상을 이용하여 파지 치료법이나 파지 생산량 증대를 위한 현실적 개선안을 제공한다.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
1) 각 strain 별 항생제의 sublethal dose 설정 ... 5
2) SUblethal dose의 항생제 존재 시 plaque size의 변화 ... 5
3) Sublethal 농도의 항생제 존재 시 bacterial morphology의 변화 ... 6
4) RecA 발현과 파아지 생산량의 상관관계 ... 7
5) SUblethal 농도의 항생제 존재시 파아지의 adsorption의 변화 ... 8
6) Sublethal 농도의 항생제 존재시 phage T4의 transcription의 변화 ... 9
7) Delayed lysis의 관찰 ... 10
8) Holin 발현량의 상대적 비교 ... 11
9) 기타 스트레스 존재시의 변화 ... 12
3. 연구개발결과의 중요성 ... 14
4. 참고문헌 ... 15
5. 연구성과 ... 18
대표적 연구실적 ... 26
끝페이지 ... 34

표/그림 (6)

표 Relationship between recA expression and phage production. (A) Determination of recA expression level in different bacteria in the presence of the sub-lethal dose of ciprofloxacin using realtime RT-PCR. * p<0.05 (B) Bacterial morphological change was observed under a light microscope. E. coli K12 strain or its recA deletion mutant (DrecA K12, see Materials and Methods) were grown in the presence or absence of the sub-lethal dose of ciprofloxacin. The box in the left shows complete lack of expression of RecA protein by a western blot analysis. Scale bar = 10 mm. (C) Observation of plaque sizes when phage T4 infected E. coli K12 strain or its recA deletion mutant (DrecA K12) in the presence of different doses of ciprofloxacin. Scale bar = 10 mm. (D) Measurement of burst sizes when phage T4 infected wild type or recA deletion mutant strain (DrecA K12) of E. coli K12 in the presence or absence of the sub-lethal dose of ciprofloxacin. ** p<0.01
표 Adsorption of phage T4 to E. coli K12 strain (M.O.I=0.01) in the presence of sub-lethal concentrations of various antibiotics. After mixing phages and fresh culture of E. coli, aliquots of culture was taken at the indicated time points and the titer of free phages was measured. Remaining phages were counted every minute for five minutes post infection. Con; control. (A) CPFX: ciprofloxacin (B) CTX: cefotaxime (C) KM: kanamycin (D) MitC: mitomycin C
표 Changes in transcription of phage T4 mRNA and replication of phage DNA in the presence of the sub-lethal concentration of ciprofloxacin (CPFX) as measured by realtime RT-PCR or realtime PCR. Total RNA or total DNA was isolated from T4-infected E. coli 13 minutes post infection and analyzed. (A) mRNA encoding T4 DNA polymerase (B) phage T4 genomic DNA (C) mRNA encoding T4 major capsid protein (D) Western blot analysis of bacterial RecA protein and phage T4 major capsid protein. GAPDH was used as an internal control. * p<0.05, ** p<0.01
표 Delayed lysis of T4-infected E. coli K12 strain in the presence of the sub-lethal doses of different antibiotics. (A) One step multiplication curve of phage T4 with or without the antibiotics inducing PAS (CPFX; ciprofloxacin, CTX; cefotaxime). An aliquot of the culture was taken and the titer of free phages were measured at each time point post infection. MOI = 0.001. Error bars are shown. (B) One step multiplication curve of phage T4 with or without the antibiotics not inducing PAS (CHL; chloramphenicol, ERY; erythromycin). MIC for each antibiotic was 16 mg/ml and 256 mg/ml, respectively. ½ concentration of MIC was used as the sublethal doses for this experiment. Error bars are shown. (C) One step multiplication curve of mutant phage T4 harboring a nonsense mutation in t (holin) gene growing in a weak suppressor strain , JM109, with or without the antibiotics (CPFX; ciprofloxacin, CTX; cefotaxime). MOI = 0.001. Error bars are shown. (D) Measurement of the burst sizes. * p<0.05, ** p<0.01 (E) Measurement of phage titer after a forced lysis at 17 minutes post infection with the addition of chloroform (5% v/v) to the culture
표 Underlying mechanism of the delayed lysis in the presence of the sub-lethal doses of ciprofloxacin (CPFX). (A) Observation of T4 holin (t) fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP) expressed in bacterial host under a fluorescence microscope at 0, 15, and 23 minutes post infection. T4_t_EGFP; engineered phage T4 expressing EGFP-fused holin (see Materials and Methods). Scale bar = 10 mm. (B) Comparison of increase in bacterial length due to filamentation and increase in T4 holin production in the presence of the sub-lethal dose of ciprofloxacin. (C) Realtime RT-PCR measurement of phage T4 holin and antiholins. T; T4 holin, rI and rIII T4 antiholins. Total RNA was isolated from T4-infected E. coli grown in the presence of ciprofloxacin at 20 minutes post infection and subjected to a realtime RT-PCR. * p<0.05
표 Changes in phage T4 production in the presence of other stresses. (A) Bacterial filamentation in the presence of the sub-lethal dose of hydrogen peroxide (4.5 mM) or elevated temperature (45oC) was observed under a light microscope. (B) One step multiplication curve of phage T4 in the presence of the two stresses. An aliquot of the culture was taken and the titer of free phages were measured at each time point post infection. MOI = 0.001

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