초록 ▼

□ 연구개요
KRAS/BRAF 돌연변이를 가진 대장암은 anti-EGFR 치료를 포함한 기존 치료에 저항성을 보이므로 새로운 치료 전략의 수립이 필수적이다. 선행연구 결과 KRAS/BRAF 돌연변이를 가진 대장암에서 세포사멸 억제단백질인 Bcl-X_L의 발현이 증가되며, 일부 세포주에서 Bcl-X_L 억제제에 반응성을 보임을 확인하였다. 그러나 Bcl-X_L 억제제에 대한 반응성이 세포주마다 다양하게 나타나므로, 약물의 저항성과 관련되는 유전자를 유전체 수준에서 종합적으로

□ 연구개요
KRAS/BRAF 돌연변이를 가진 대장암은 anti-EGFR 치료를 포함한 기존 치료에 저항성을 보이므로 새로운 치료 전략의 수립이 필수적이다. 선행연구 결과 KRAS/BRAF 돌연변이를 가진 대장암에서 세포사멸 억제단백질인 Bcl-X_L의 발현이 증가되며, 일부 세포주에서 Bcl-X_L 억제제에 반응성을 보임을 확인하였다. 그러나 Bcl-X_L 억제제에 대한 반응성이 세포주마다 다양하게 나타나므로, 약물의 저항성과 관련되는 유전자를 유전체 수준에서 종합적으로 연구할 필요가 있다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 유전체 편집기술 기반의 기능 유전체학적 스크리닝을 통하여 KRAS/BRAF 돌연변이 대장암에서 Bcl-X_L 억제제의 반응성을 결정하는 분자 기전을 규명하고, 약물 저항성 극복을 위한 병용치료 전략을 수립하는 것을 목표로 한다.

□ 연구 목표대비 연구결과
○ CRISPR/Cas9 라이브러리 in vitro 스크리닝을 통한 Bcl-X_L 억제제 반응성 관련 유전자 발굴
- 대장암 세포주에서 Bcl-X_L 억제제 ABT-263의 반응성 측정: 3개 세포주에 대한 반응성 확인
- 3개 대장암 세포주를 대상으로 ABT -263 반응성 관련 genome-wide CRISPR 스크리닝 시행: 스크리닝 결과 Wnt pathway가 공통적으로 enrich 됨을 확인
○ CRISPR/Cas9 라이브러리 in vivo 스크리닝을 통한 Bcl-X_L 억제제 반응성 관련 유전자 발굴
- Genome-wide CRISPR 라이브러리가 infection된 세포주를 이용하여 마우스 xenograft를 만들고 ABT-263을 처리하여 저항성 세포 분석: 저항성 관련 후보 유전자 및 관련 pathway 확인
○ 후보유전자의 약물반응성 관련성 검증 및 작용의 분자 기전 연구
- TCGA 유전체 데이터베이스 분석: 환자조직에서 Wnt pathway signature 및 mutation이 Bcl-2 family 유전자 발현과 관련성이 있음을 확인
- β-catenin 과발현 및 knock-down 실험: Wnt pathway에 의한 ABT-263 반응성 조절 확인
○ Bcl-X_L 억제제의 반응성을 증가시키는 약물 탐색
- Wnt pathway 억제제 스크리닝: 5개의 Wnt pathway 억제제를 2종의 대장암 세포주에서 스크리닝하여 ABT-263과 가장 synergistic effect가 높은 NCB-0846을 선정함
○ KRAS/BRAF 돌연변이 대장암 세포주에서 Bcl-X_L 억제제 기반의 병용치료 효과 검증
- 대장암 세포주에서 NCB-0846과 ABT-263 병용투여 효과 확인: 추가적인 2종의 대장암 세포주에서 synergistic effect 확인
- 세포주에서 NCB-0846과 ABT-263의 병용투여 효과 검증: 두 약제의 처리에 의한 mitochondria depolarization, annexin V/propidium iodide staining 및 PARP/caspase 3 cleavage 증가 확인
- RNA sequencing: 두 약제 투여에 따른 transcriptome 분석 및 변화 pathway 확인
○ 대장암 patient-derived xenograft 모델을 이용한 Bcl-X_L 억제제 기반의 병용치료 효과 검증
- KRAS 유전자 돌연변이가 있는 PDX 모델에서 NCB-0846과 ABT-263의 병용투여 효과 검증: 두 약제의 단독투여 대비 병용투여에서 synergistic 한 효과를 보임을 확인

□ 연구개발결과의 중요성
○ Bcl-XL 억제제의 세포내 작용에 대한 분자 기전 및 약물의 반응성에 대한 분자 기전 이해: Wnt pathway가 Bcl-2 family 신호경로와 cross-talk이 있음을 최초로 밝혀낸 결과임
○ Genome-wide CRISPR/Cas9 스크리닝을 실제로 도입하여 실험 조건을 확립하였고, 이러한 스크리닝을 통해 확보된 후보 유전자 및 신호경로가 실제로 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었음
○ Bcl-X_L 억제제 및 Wnt pathway 억제제의 병용 요법을 통한 기존에 존재하지 않았던 새로운 접근의 대장암 치료법을 제안함
○ 유전자 수준의 genome-wide 스크리닝으로부터 후보 유전자 및 신호경로를 확보하고, 세포주 및 약물 검색을 통해 후보약물을 선정하며 PDX 모델을 통해 이를 검증하는 신약개발 및 drug repositioning 프로세스가 효과적임을 확인할 수 있었음
○ Bcl-X_L 및 Wnt pathway가 표적치료의 타겟이 될 수 있음을 확인함으로써 추가적인 약물 개발을 위한 분자 기전적인 근거를 제공하는 연구임

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
• 1차년도 목표1: CRISPR/Cas9 라이브러리의 in vitro 스크리닝을 통한 Bcl-XL 억제제 반응성 관련 유전자 발굴 ... 5
• 1차년도 목표2: CRISPR/Cas9 라이브러리의 in vivo 스크리닝을 통한 Bcl-XL 억제제 반응성 관련 유전자 발굴 ... 7
• 2차년도 목표1: 후보유전자의 약물반응성 관련성 검증 및 작용의 분자 기전 연구 ... 8
• 2차년도 목표2: Bcl-XL 억제제의 반응성을 증가시키는 약물 탐색 ... 9
• 3차년도 목표1: KRAS/BRAF 돌연변이 대장암 세포주에서 Bcl-XL 억제제 기반의 병용치료 효과 검증 ... 10
• 3차년도 목표2: 대장암 patient-derived xenograft (PDX) 모델을 이용한 Bcl-XL 억제제 기반의 병용치료 효과 검증 ... 12
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 12
• 4. 참고문헌 ... 13
• 5. 연구성과 ... 15
• 대표적 연구실적 ... 17
• 끝페이지 ... 23