보고서 정보
주관연구기관 |
순천대학교 SunChon Natinal University |
연구책임자 |
김대헌
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2020-03 |
주관부처 |
과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT |
등록번호 |
TRKO202000004092 |
DB 구축일자 |
2020-07-29
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키워드 |
유전자 발현.재조합 유전자.재조합 단백질.단백질 정제시스템.초거대 분자 조립체.자가 조립체.자가 절단 단백질 분해효소.단백질 의약품.벡터 플랫폼.
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초록
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□ 연구개요
단백질 의약품의 효율적 대량생산을 통해 가격 경쟁력을 갖추기 위해서는 무엇보다도 전체 생산 비용의 약 45~92%를 차지하는 정제비용을 최소화 하는 전략이 무엇보다 필요하다. 본 연구에서는 재조합 단백질의 고발현, 세포 내 안정적 저장, 그리고 분리·정제에 필요한 다양한 기능성 단위체를 포함하는 재조합 유전자 발현용 all-round 벡터 플랫폼을 디자인할 것이다. 이를 통해 정제 단계의 특정 조건하에서 고부가 가치의 의료용 단백질을 포함하는 재조합 단백질이 초거대 분자 조립체로 형성되도록 유도함으로써 원심분리,
□ 연구개요
단백질 의약품의 효율적 대량생산을 통해 가격 경쟁력을 갖추기 위해서는 무엇보다도 전체 생산 비용의 약 45~92%를 차지하는 정제비용을 최소화 하는 전략이 무엇보다 필요하다. 본 연구에서는 재조합 단백질의 고발현, 세포 내 안정적 저장, 그리고 분리·정제에 필요한 다양한 기능성 단위체를 포함하는 재조합 유전자 발현용 all-round 벡터 플랫폼을 디자인할 것이다. 이를 통해 정제 단계의 특정 조건하에서 고부가 가치의 의료용 단백질을 포함하는 재조합 단백질이 초거대 분자 조립체로 형성되도록 유도함으로써 원심분리, 여과 또는 자석 등의 간단한 방법만으로 재조합 단백질을 정제할 수 있는 기술, 그리고 특정 조건하에서 초거대 분자 조립체로부터 목적 단백질만을 고순도로 분리할 수 있는 기술을 개발하고자 한다. 이를 통해 고가의 resin 및 단백질 분해효소 처리과정 등이 필요한 기존의 affinity tag을 이용한 고비용, 저효율의 재조합 단백질 정제 시스템을 대체할 수 있는 새로운 정제 시스템을 개발하고자 한다.
□ 연구 목표대비 연구결과
본 연구에서는 특정 inducer 처리 조건하에서 초거대 분자 조립체 형성을 유도하여 원심분리, 여과 또는 자석 등의 간단한 방법만으로 재조합 단백질을 정제할 수 있는 새로운 개념의 재조합 단백질 정제기술을 개발하고, 실제 의료용 단백질 정제에 적용함과 동시에 그 효능을 검증하는 것을 목표로 하고 있다. 이러한 목표 달성을 위해 다음과 같은 연구결과들을 도출하였다.
1. 페리틴, MtrB, 18A, ELK16, L6KD, GFIL8, calmodulin-M13, TnI-Tnc, FKBP-FRAP 조합 등을 포함하는 다양한 자가 조립체 유도 펩타이드, 도메인, small protein, 그리고 디자인된 small peptide를 GFP와 fusion 함으로써 형광현미경, 원심분리, 여과, 또는 자석 등의 방법으로 초거대 분자 조립체 형성 유무를 쉽게 screening 할 수 있는 시스템을 구축하였음.
2. 구축된 screening system을 바탕으로, 재조합 단백질 정제시스템으로의 활용 가능성이 매우 우수한 다양한 IDSA (inducer dependent self-assembly) units, 즉 Ca2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+ 등의 ions에 의해 초거대 분자 조리체가 유도되는 IDSA units을 screening 하였음.
3. 재조합 단백질의 고효율, 고순도 분리 정제를 위해 inducer type 및 처리농도, pH, buffer type, salt 농도 등의 미세환경 조절을 통해 최적화된 정제법을 구축하였으며, 일부 IDSA unit의 경우 정제순도가 90% 이상의 높은 purity를 확보할 수 있는 정제법을 세팅하였음.
4. 최종적으로, 특정 inducer 처리 조건하에서 5,000 rpm, 5 min 이하의 저속 원심분리만으로 높은 purity 및 정제효율을 보이는 Amp-S tag 및 Amp-M tag을 디자인 하였으며, 이렇게 개발된 새로운 개념의 정제 시스템을 실제 protein drug rhG-CSF의 정제에 적용하여 고순도로 정제하는데 성공하였음.
5. 이와 동시에, 본 정제 시스템이 fusion 된 rhG-CSF의 식물 세포 내 고발현, strorage를 위하여 다양한 세포 소기관 targeting용 all-round 벡터 플렛폼을 구축하였으며, 특히 rhG-CSF가 엽록체 stroma로 targeting 되는 애기장대 형질전환 식물체를 제조하였음.
6. 정제된 rhG-CSF의 효능검증을 위해 M-NFS-60 cell proliferation assay를 수행하였으며, Amp-S tag 및 Amp-M tag의 유무에 관계없이 높은 bioactivity를 보임을 확인하였음. 추가적으로, G-CSF 처리시 하위의 신호전달 과정에 위치한 Stat3의 인산화 정도를 anti-phospho-Stat3 antibody를 이용하여 immunoblotting을 수행한 결과, 상업적으로 판매되는 rhG-CSF (Thr31-Pro204, expressed in human 293 cells) positive control과 비교하여 동일한 활성을 가지고 있음을 확인하였음.
□ 연구개발결과의 중요성
본 연구를 통해 구축된 정제시스템은 기존의 복잡·고비용의 재조합 단백질 정제 시스템을 대체할 획기적인 기술이 될 것이다. 단백질 의약품의 고비용 문제로 인해 그 활용에 있어 제한적인 경우가 많은데, 정제 비용을 획기적으로 줄일 수 있는 새로운 정제 시스템의 개발은 많은 단백질 의약품의 활용범위를 광범위하게 넓혀 줄 것이다. 또한 삼성바이오로직스, 셀트리온, 한미약품 등을 포함하는 많은 국내의 바이오 기업들이 단백질 의약품의 연구, 개발 및 생산에 큰 강점을 가지고 있는데, 본 연구결과의 접목은 국내 바이오 의약품 산업의 국제적 경쟁력을 획기적으로 높이는 데 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다. 재조합 단백질의 정제 시스템 개발과 관련된 연구는 대부분 국외를 중심으로 개발되었으며, 관련 산업 또한 그 기술에 절대적으로 의존하고 있다. 따라서 해외 수입에 의존하고 있는 재조합 단백질의 분리·정제시스템의 기술독립을 통해 큰 수입 대체효과를 가져올 것이다. 나아가 본 연구는 미래 국내 바이오 산업의 발전을 이끌 신진(전문) 연구 인력 및 후학 양성에 큰 기여를 하고 있다고 사료된다.
(출처 : 연구결과 요약문 2p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 연구결과 요약문 ... 2
- 목차 ... 3
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
- 가. 연구개발의 필요성 ... 4
- 나. 최종 연구목표 ... 4
- 다. 연구내용 및 범위 ... 4
- 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
- 3. 연구개발결과의 중요성 ... 13
- 4. 참고문헌 ... 15
- 5. 연구성과 ... 15
- 붙임. 주관연구책임자(공동연구원 포함) 대표적 논문‧특허실적 요약문 ... 19
- 끝페이지 ... 30
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