초록 ▼

4. 당해년도 연구결과 요약
가. 제1세부과제명 : 돈단독백신 검정기준 효력 시험법 개선에 관한 연구
1. 시험균 준비 및 확인
- 돈단독균 ER(Erysipelothirix rhusiopathiae)-T2 균을 PCR법으로 확인하였으며 공격 접종 시험용 균주는 배양 후 2ml 씩 분주하여 동결건조 300 vials 생산 후, 냉동보관함.
2. 공격접종 방범에 따른 공격접종 반수치사량(LD50) 설정
- ER-T2 균의 동결 및 배양 공격접종 반수치사량 LD50 확인 결과 방법에 따라，복강 접종시 동결액은

4. 당해년도 연구결과 요약
가. 제1세부과제명 : 돈단독백신 검정기준 효력 시험법 개선에 관한 연구
1. 시험균 준비 및 확인
- 돈단독균 ER(Erysipelothirix rhusiopathiae)-T2 균을 PCR법으로 확인하였으며 공격 접종 시험용 균주는 배양 후 2ml 씩 분주하여 동결건조 300 vials 생산 후, 냉동보관함.
2. 공격접종 방범에 따른 공격접종 반수치사량(LD50) 설정
- ER-T2 균의 동결 및 배양 공격접종 반수치사량 LD50 확인 결과 방법에 따라，복강 접종시 동결액은10^3.5±0.5LD50/0.2ml, 배양액은 10^5.4±0.1LD50/0.2ml 이었고，피하 접종시 동결액은 10^5.2±0.6LD50/0.2ml, 배양액은 10^7.2±0.7LD50/0.2ml로 확인됨.
- 공격접종 확인결과 단독균 ER-T2주의 경우，배양하여 피하접종시 병원성이 가장 높게 나타나는 것으로 확인됨.
3. 시판백신 공격접종 방법(복강 및 피하)에 따른 효능평가 비교 시험
- 최근 면제 신청된 국내 5개 제조사 및 수입사의 돈단독 시판 9개 백신 1/10두분을 마우스(백신별 10수) 피하에 접종한 2주후 동결 및 배양균을 복강과 피하에 각각 100LD₅₀로 공격접종 한 결과，복강 및 피하 공격 접종 부위에 따른 결과 대조군은 모두 100% 폐사하였고，8개 백신의 백신 접종군은 0%의 폐사율을 확인하였음
- F 백신의 경우 동결건조 및 배양균 복강 및 피하로 공격 접종하였을 때，접종 부위에 따른 폐사율이 각각 90%, 100%로 확인되었으며，시험 결과는 거의 유사하게 어떤 시험법을 적용하여도 불합격 되는 것을 확인함.
4. 검정백신 공격 접종 방법(복강 및 피하)에 따른 평가 비교 시험
- 최근 검정 신청된 백신의 복강 및 피하 공격 접종 부위에 따른 시험 결과 a, b, c 백신은 동결건조 및 배양균을 복강 및 피하로 공격접종 하였을 때 모두 0%의 폐사하였으며，대조군은 모두 100% 폐사하여 어떤 시험법을 적용하여도 합격하였음.
- d 백신의 경우 어떤 시험법을 적용하여도 불합격 되는 것을 확인함.
- 100LD₅₀ 농도를 정확히 측정하여 공격접종 할 경우, 공격주의 성상이 동결건조와 배양액의 평가 결과가 일치하였으며，접종 시험법 또한 피하접종이나 복강접종으로 방법이 다르더라도 동일한 평가 결과가 확인됨.

나. 제2세부과제명 : 흉막폐렴백신 국가검정기준 개선에 관한 연구
1. 시험균 준비 및 확인
- Actinobacillus pleuropneumoniae(APP) serotypel (P-APP-10-27-2), serotype2 (P-APP- 09-41-8), serotype5 (P-APP-09-7-10) 균주를 PCR등으로 성상을 확인하였으며，연구사업에 사용함.
- 각 APP균의 동결 및 배양 공격접종 반수치사량 LD50에 대한 실험을 3반복 실시하였으며，그 결과 1，2, 5형 2배 농축하여 공격접종하여도 폐사가 일어나지 않아 배양액을 통해 공격접종 시험을 수행하였으며，배양액은 1，2, 5 혈청형별로 각각 10^2.9 CFU/0.1ml, 10^1.7 CFU/0.1ml, 10^2.5 CFU/0.1ml 로 확인됨
2. ELISA 항원, APP 항혈청 제작 및 적용
- 단백질 수거량 및 특이도 평가결과에 따른 OMP ELISA 항원 추출방법을 정하였다.
- 검정에 사용될 실험동물은 마우스의 경우 혈청 수거량이 적고，토끼의 경우 음성대조군의 OD값이 높아， 혈청량 및 ELISA P/N 값 비교하여 실험동물은 기니픽으로 선정하였다.
- APP ELISA 최적조건은 음성혈청대비 양성혈청(P/N) 값이 가장 높은 조건을 선택하였으며，혈청희석 250 배，코팅항원농도는 250ug/well(100ul)，Conjugate 희석농도 1: 50,000을 적용하였으며，조건에 따른 QIA ELISA의 양성혈청은 OD값 1.0 이상，음성혈청은 OD값 0.2이하로 설정하였다.
- 시판 ELISA의 Guinea pig에 대한 APP 혈청역가시험을 위하여 Conjugate(Anti-Guineapig IgG) 농도별 S/N 값을 분석한결과 1:50,000배 희석에서 가장 높은 결과를 나타내어 시판 ELISA 에대한 Conjugate 희석농도를 1: 50,000으로 적용하였으며，조건에 따른 ELISA 수행시 제작 양성음성 혈청의 적용시 양성혈청은 OD 값 1.5 이상，음성혈청은 OD값 0.4이하로 설정하였다.
3. 흉막폐렴 백신 ELISA 기준 설정 시험(기니픽)
- QIA ELISA의 APP 1형은 및 2형은 S/P값이 0.3이상，APP 5형은 S/P값이 0.4이상，A사 시판 ELISA는 APP 2형 및 5형 모두 S/P값 0.4 이상으로 양성판정 기준을 설정하였다.
- 현행 검정기준의 APP ELISA 4단계(24) 이상일때 양성으로 판정하고, 이에 따라 연구사업을 통해 설정된 S/P값에 따른 흉막폐렴 면역 혈청의 특이도 민감도 시험결과 대부분 값에서 90%이상의 특이도 민감도를 확인하였다.
- 응집시험에 대하여 ELISA의 특이도 민감도를 평가한 결과 APP 1형의 경우 민감도 73%，특이도 79% 였으며，APP 2형의 경우 민감도 87%, 특이도 100%로 확인되었다.
- 또한 검역본부 제작 ELISA와 시판 ELISA의 특이도 민감도를 비교한 결과 흉막폐렴 2형 ELISA의 경우 민감도 및 특이도가 98% 및 90%로 확인되었으며，5형 ELISA의 민감도 및 특이도는 90% 및 100%로 확인되었다.
4. 흉막폐렴 시판백신 공격접종 및 응집시험，ELISA효능평가 비교 시험
- 혈청형별 마우스 공격접종 시험에서 모두 대조군은 100% 폐사하였으며，시험군은 80% 이상의 방어능을 보였으며，접종군 혈청의 응집역가가 모두 80배이상으로 확인되어 국가출하승인검정 기준에 적합한 3개 백신을 농도별로 기니픽에 피하로 접종하였다. ELISA 적용 시험 결과 1/4배 및 1/10배 접종시 기준에 합격하는 것으로 판단되며，백신의 효능 평가가 ELISA법으로 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 QIA ELISA 및 시판 ELISA 적용시 특이도 민감도 평가결과 모두 90%이상으로 확인되었으며，추후 APP 1형에 대한 특이도 민감도 분석 및 백신 검정 합격 여부를 추가로 평가하고자 한다.
5. 흉막폐렴 시판백신 공격접종의 목적동물 항체 역가 시험
- 시험동물을 이용한 검정 합격 백신이 목적동물에서의 항체 형성능 평가 및 상관관계를 확인하기위하여，앞에서 사용된 검정합격 A, B 백신을 각 백신 부표의 접종법에 따라 목적동물(돼지) 접종하였으며，백신별로 1두분 및 1/10두분을 그룹별 5마리에 접종하여 항체 형성능을 확인하였다.
- 수거된 돼지 혈청을 국외 시판 ELISA를 이용하여 항체가를 시험한 결과，백신접종 후 접종 농도에 비례하여 흉막폐렴 각 혈청형에 대한 항체 형성(Sero-conversion，양성기준 S/P〉=0.5)을 확인하였다.

(출처 : 4. 당해년도 연구결과 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• III. 연구결과 ... 7
• IV. 연구결과요약 ... 21
• V. 금후 추진계획 ... 24
• VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 25
• VII. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 25
• VIII. 주요연구 변경사항 ... 25
• 끝페이지 ... 25