초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
가. 야외바이러스와의 감별을 위한 마커 적용 한국형 백신의 개발 및 혈청학적 감별능 평가
1. 야외 바이러스 감별용 마커 삽입 또는 결손 cDNA 감염성 클론과 바이러스 제작
- 감별을 위해 3A_L (3A large deletion, 3A 93-143aa)이 결손된 cDNA 클론을 제작하였음.
- 3B3 (각각 A type 및 SAT type의 3B3 region)를 cDNA clone에 추가하여 디자인된 3B12333 클론을 작성하였고,
- 3B12333 클론

5. 최종 연구결과 요약
가. 야외바이러스와의 감별을 위한 마커 적용 한국형 백신의 개발 및 혈청학적 감별능 평가
1. 야외 바이러스 감별용 마커 삽입 또는 결손 cDNA 감염성 클론과 바이러스 제작
- 감별을 위해 3A_L (3A large deletion, 3A 93-143aa)이 결손된 cDNA 클론을 제작하였음.
- 3B3 (각각 A type 및 SAT type의 3B3 region)를 cDNA clone에 추가하여 디자인된 3B12333 클론을 작성하였고,
- 3B12333 클론에 NSP ELISA에서 주로 사용하고 있는 3B12 부위를 제거함으로서 3B1와 3B2를 결손시킨 3B333의 형태로 디자인하였음
- 3A부위가 크게 결손된 3AL바이러스를 제작하여 확보하였고
- 3B12가 결손되고 3B3가 2개 추가된 3B333 바이러스도 확보되었음
2. 감염항체와 백신항체 감별을 위한 혈청학적 감별능 평가
- 각 제작된 바이러스의 돼지 접종에 의한 양성혈청 확보
- 병원성 조사결과 새로 제작된 바이러스는 돼지에서 병원성이 없었음
- 감별능 평가결과 3B ELISA 및 3A ELISA 의하여 감별진단 가능성 확인
- 3AL+ 3B333의 표현형을 지닌 바이러스를 제작하여 double marker로 이용이 가능하도록 조작하였음

나. 유전자 조작을 통한 저항성 백신바이러스의 제작 및 평가
1. 각종 혈청형 바이러스를 접종세포의 온도를 올려 배양하여 환경저항성 바이러스의 제작
- 37도로부터 지속적으로 상승시켜 41도의 온도조건에서 바이러스를 계대 배양함
- 37도 2시간 처리조건 (O Manisa, Asia1, SAT1, SAT3 바이러스의 저항성), 4시간(O Manisa, Asia1, SAT1,SAT2), 6시간 처리 (O Manisa, Asia1, SAT1, SAT2)에서 온도변화로 처리되지 않은 바이러스보다 각각 바이러스의 역가가 상승되는 것으로 확인됨.
- 41도 조건에서도 2시간 처리조건 (O Manisa, A22, Asia1, SAT2, SAT3 바이러스의 저항성), 4시간(O Manisa,A22, Asia1, SAT1)에서 온도변화로 처리되지 않은 바이러스보다 각각 바이러스의 역가가 대부분 상승되는 것으로 확인됨.
- 유전자 분석을 통해 VP1 및 VP3의 아미노산 변화가 관찰되었고 와 특히 대부분의 바이러스에서 3C의 아미노산 변화가 특징적이었음.
2. 재조합 구제역바이러스 혈청형 7종에 대한 환경 저항성 유전자의 변이
- 이미 확보된 재조합바이러스 7종에 대해서 알려져 있는 저항성유전자인 VP2 H145Y, VP1 N17D, VP2 H93C 등의 유전자를 변화시켜 온도에 저항성이 있는 바이러스를 제작하였음
- 42도에서 2시간 처리(O Manisa, O PanAsia2, C, A22, Asia1, SAT3)의 역가가 상승이 관찰.
- 따라서 대부분의 바이러스가 환경에 저항성이 있는 바이러스로 전환되는 것을 확인.
3. 고능력 구제역항원 생산을 위한 세포주의 작성
- 구제역 바이러스의 세포 수용체인 integrin avb3, avb6, avb8를 지속적으로 발현하는 세포를 작성하여 대부분 혈청형의 구제역바이러스의 증식성이 상승되는 것을 확인.
4. 구제역 재조합바이러스 7종의 감수성 동물에서의 병원성 및 항체 특이성조사
- 돼지에서 가장 낮은 병원성을 갖는 바이러스는 O Manisa와 SAT2-SAU 이었음. 중간정도의 병원성은 SAT1-SA, AsiaMOG의 경우이었으며, C-Ob, O-PanAsia2, A22, SAT3-SA은 병원성이높았음.
- 마우스 성축(C57/BL6)에서는 C-Ob와 O-PanAsia2가 가장 체중 감소를 보였고 A22가 중간 정도, 나머지는 유사한 결과를 보였음.
- 포유마우스에서는 C-Ob, O-PanAsia2가 가장 빨리 높은 폐사율이 확인되었고, A22, AsiaMog, SAT1-SA,SAT3-SA의 경우 약간 지체되어 폐사가 되었음. 병원성이 거의 없는 것은 SAT2 와 O Manisa이었음
- 다른 혈청형과의 교차 중화시험에서도 대부분 디자인된 혈청형에서만 중화항체가 형성되는 경향을 보여 혈청형별 구제역 백신을 인위적으로 작성할 수 있다는 것이 목적 동물실험을 통해 증명되었고, O, A, Asia1형은 서로 간에 일부 교차반응은 형성.
5. 구제역 재조합 7종 항원의 염소에서의 면역원성 조사
- 7종항원이 삽입된 백신으로 제작하여 접종후 1주부터 모든 혈청형에 대한 중화항체가 방어수준으로 형성되었으며, 대부분 높은 중화 항체가를 보였음.
- 제작된 항원은 백신 항원으로서 가능성을 확인.

다. 한국형 백신주 작성시스템의 병원성 및 안전성 평가
1. 세포배양에 적응된 비병원성 바이러스 (O type)의 병원성 인자 분석
- P1 region이 병원성과 연관되어 동물에서의 병원성차이를 보이는 것이 확인되었음
- 병원성 부위 분석결과 P1중 VP1으로 확인되었음
- O형 (O mansia, O/SKR/Andong/2010)의 경우 세포계대후 VP1 83K 부위가 세포의 표면 부위로 병원성 인자로 평가됨
2. 계대를 통한 바이러스 O형의 병원성 변화 및 평가
- O/Andong/SKR/2010바이러스는 50대 계대 이후 병원성이 급격히 사라졌으며, 이러한 부위의 염기서열의 관찰은 90대 계대된 바이러스에서 6개의 염기서열의 변화가 관찰되었으며,
- 3454(S→P), 3616 nt (L→T)가 병원성에 영향을 주는 중요한 변화로 판단되고 있음
3. 계대를 통한 바이러스 Asia1 형의 병원성 변화 및 평가
- Asia1 혈청형 (Asia1 Shamir)의 경우 10대 계대 이후 병원성의 변화가 관찰되었으며, 20대 이후에 C57BL/6 마우스에서 완벽히 병원성이 없어졌음
- VP1 서열에서 2개의 아미노산 변화를 보였으며, 5'UTR에서 T848C로 변화되었고, 3D에서 T7351C의 변화가 있었으나 아미노산의 변화는 관찰되지 않았음
4. 비병원성 재조합 바이러스들의 제작과 병원성 조사
- type A의 A24 5’ UTR 및 3’ UTR 교체 진행 (3‘UTR 완료)
- 3’ SL1 loop 제거에 의한 비병원성 재조합바이러스의 Asia1형 바이러스 확보
- Lb 유전자 비활성화 바이러스 제작 (A, Asia1 바이러스 확보)
- 3C mutation 에 의한 Asia1 형 바이러스 확보
- 확보된 바이러스의 마우스 병원성 시험 결과 Lb (SAP) 및 3C mutant에서 병원성 감소 확인
- 돼지 실험결과 VP1 E83K 의 병원성 감소 확인

(출처 : 5. 최종 연구결과 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• Ⅲ. 연구결과 ... 7
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 47
• Ⅴ. 고 찰 ... 49
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 51
• Ⅶ. 참고자료 ... 52
• 끝페이지 ... 53